血细胞单采制备富血小板血浆治疗难愈性创面的效果观察

周鹏，温子欢，罗琳，徐甜，刘欣雨

（1.江西省上饶市立医院输血科；2.江西省上饶市立医院骨科，江西 上饶 334000）

难愈性创面是指不能通过正常愈合机制治愈的创面，患者往往伴有糖尿病、感染、压疮等[1]，不仅治疗难度大，而且治疗效果往往不理想。富血小板血浆(Platelet rich plasma，PRP)采集自身血液制备，作为自体生长因子的来源，具有极强的修复作用[2]，并且安全可靠。目前PRP临床广泛应用于骨科、整形美容外科、口腔科等学科。近年来，中外大量文献[3-5]报道PRP应用于难愈性创面取得良好的效果，但目前PRP的制备方法和治疗方案均未统一，直接对最终治疗效果有所影响。本文对血细胞分离单采制备PRP，运用于难愈性创面治疗所取得的良好效果，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2019年1月至2020年5月难愈性创面患者19例，其中男性13例，女性6例；年龄54～72岁，平均年龄61.4±5.5岁；其中糖尿病足13例、褥疮1例、骨骼或肌腱组织外露3例、深层肌肉组织暴露1例、脉管炎引起下肢皮肤溃烂1例。

1.1.1 纳入标准 （1）年龄及性别不限；（2）若患有其他疾病，需经过正规治疗后病情平稳；（3）创面经清创换药、负压封闭引流及静滴抗生素治疗至少4周以上且无好转迹象或持续恶化；（4）没有用过免疫抑制剂的患者；（5）取得患者及家属同意并签署知情同意书。

1.1.2 排除标准 （1）血红蛋白＜100 g/L，血小板＜150×109/L；（2）有精神疾病以及无自知力，依从性差者；（3）孕妇、哺乳期的妇女；（4）伴有血液疾病；（5）近期服用过抗凝剂，近期服用过免疫抑制剂。

1.2 仪器设备 血细胞分离机（COM.TEC，德国费森尤斯公司）；血小板分离管路（C5L，德国费森尤斯公司）；全自动血细胞分析仪（BC-6900，深圳迈瑞公司）；-80℃超低温保存箱（DW-86L338J，青岛海尔公司）；一次性无菌离心管(美国CORNING公司)。

1.3 治疗方法

1.3.1 PRP制备 根据患者创面大小及其基础血小板值，设置采集PRP修复的最佳浓度（1000-1500×109/L）[6]，采集量（100～150 mL）使用血细胞分离机及其专用管路采集PRP，采集过程中留取患者血浆50 mL备用。采集后充分混匀并检测初始PRP浓度，如超过预期值，可用患者自身血浆进行稀释。在超净工作台中，使用无菌吸样管分装至无菌离心管中，每管10 mL，取一管立即使用，其余放置于-80℃超低温冰箱中保存备用。再次使用时，放置37℃水浴箱，震荡复融并检测其浓度。

1.3.2 PRP凝胶制备 取200 U凝血酶冻干粉，加入2 mL葡萄糖酸钙注射液，作为激活剂，使用前与制备好的PRP1:10混合后，充分混匀，制备成PRP凝胶。

1.3.3 PRP治疗 对患者创面进行彻底清创，清除坏死组织和炎性肉芽组织，将制备好的PRP凝胶均匀覆盖在创面上，使用无菌凡士林纱布固定住PRP凝胶，让PRP中的生长因子持续作用于创面上，再行包扎。每5d进行一次PRP治疗。

1.4 观察指标 （1）PRP浓度监测，观察超低温保存对其浓度是否有影响。（2）记录PRP治疗次数、创面体积及创面愈合情况，将创面愈合分为4级：痊愈：完全愈合，覆盖率达到100%；显效：患者创面明显愈合，且覆盖率达到75%～100%；有效：创面有效愈合，覆盖率为25%～75%，无效：无愈合，覆盖率低于25%。（3）细菌培养检测：分别对PRP治疗前、后患者创面分泌物进行细菌培养，观察感染情况。（4）安全性：治疗过程中，观察并记录患者是否存在创面扩大、感染加重等不良反应。

1.5 统计学分析 采用SPSS 19.0进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，计数资料用百分比表示。创面体积以及创面覆盖率组间使用方差分析；对每次PRP浓度进行配对t检验观察是否有统计学意义，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PRP浓度19例患者基础血小板（231.16±82.11）×109/L，制备PRP中浓度为（1248.26±149.51）×109/L，平均提升5.4倍。分别在使用前测试各管PRP浓度，初始制备（1号）与超低温存放（2-10号）不同时间的PRP浓度未见明显差异，P＞0.05，见表1。

表1 各管间PRP浓度比较（±s；浓度单位：109/L）

表1 各管间PRP浓度比较（±s；浓度单位：109/L）

PRP浓度t 1 1249.43±139.21 2 1231.14±128.78 0.54 3 1280.29±119.24 0.93 4 1236.43±131.21-0.69 5 1205.71±120.35 1.03 6 1142.29±167.38 1.51 7 1273.71±142.33 1.08 8 1295.44±123.35 1.37 9 1305.24±158.10-0.6 10 1412.31±125.25-1.17

图2 患者中年男性，糖尿病足，外伤引起左足大面积皮肤脱套伤，植皮术后足背皮肤坏死，创面45天难以愈合，行PRP治疗8次后创面愈合。

2.2 PRP治疗效果观察 经过4-10次PRP治疗，平均7.29次，患者的创面减小，肉芽组织填充完好，创面体积和覆盖率明显改善，15例患者痊愈，4例患者显效。见表2、图1-2。

图1 患者老年男性，糖尿病足并感染，行截肢清创植皮术后皮肤坏死，创面难以愈合1月余，行PRP治疗8次后，创面愈合。

表2 19例患者治疗前后创面体积与覆盖率的比较（±s）

表2 19例患者治疗前后创面体积与覆盖率的比较（±s）

治疗前 治疗8次 治疗10次 F P创面体积（mL）覆盖率（%）治疗2次6.16±2.27 47.41±23.14治疗4次 治疗6次4.72±2.31 56.46±22.44 10.84±3.22 1.23±1.16 88.65±13.40 3.28±2.08 70.54±19.27 0.92±1.43 91.51±10.31 13.28 11.46＜0.01＜0.01

2.3 细菌培养情况 治疗前创面细菌培养阳性的患者有16例（84.21%），治疗后，创面细菌培养阳性者2例（21.05%），显著低于治疗前，差异有统计学意义（χ2=20.69，P＜0.01）。见表3。

表3 19例患者治疗前后创面细菌培养结果的比较（n/%）

2.4 安全性 整个治疗过程中，未出现患者创面扩大、感染加重等不良反应。患者对治疗满意度高。

3 讨论

难愈性创面影响因素繁多，衰老、细菌感染、局部生长因子的含量下降等因素均可抑制创面再生，致创面难以愈合[7-8]，给患者身心带来巨大痛苦。

富血小板血浆（PRP）是人体血液通过密度离心得到的富含血小板的血浆成分，其中含有包括血小板源性生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)、转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、成纤维细胞生长因子 (fibroblast growth factor，FGF)、胰岛素样生长因子1(insulinlike growth factor 1IGF-1)等大量生长因子[9]。血小板通过凝血酶和钙激活后可以脱颗粒释放上述生长因子[10]，达到修复的目的。有研究表明，PRP需要达到特定浓度，才能发挥最佳修复作用[6]。目前临床使用PRP制备方法以PRP套装和抗凝管二次离心法[4-5]为主，这两种方法在面对大面积创面时，不但需要反复采集患者血液，而且得到PRP的体积也有限，增加患者痛苦和治疗费用。

本研究通过血细胞分离机制备PRP，根据患者基础血小板值、患者PRP治疗内容、患者创面的大小等情况制定治疗方案，只采集所需的血小板，其余血液均回输，避免患者医源性失血。根据文献报道[11]，此方法能安全有效的得到血小板制品，对患者的血细胞计数影响极小，在短时间内血小板即可恢复到采集前水平。血细胞分离机单次采集即可保证PRP的体积和浓度，并通过分装后的超低温保存，达到多次、大面积治疗的目的，这是手工制备PRP所无法比拟的。从结果中可以看出，PRP浓度和治疗次数得到保证，创面体积及创面覆盖率明显改善，减少患者的经济负担，提高患者的生活质量，患者满意度也随之增高。

本研究中还观察到，超低温保存的PRP，其浓度未见明显改变。根据文献报道[12]，血小板低温保存状态下，保存液添加与否对其浓度无显著变化，未添加保存液会造成血小板激活内容物质释放。PRP的修复原理正是需要激活血小板的相关因子，达到修复功能，所以我们在PRP的低温保存过程中未添加任何保存液。超低温保存血小板的推荐保存条件为-80℃，保存时间6个月，在此条件下血小板回收率可达到99%；解冻后的最佳使用时间为2 h内[13]，本文按此方法处理PRP，使用效果理想。有学者[14]在动物模型试验中发现，低温保存PRP与新鲜PRP具有同样修复作用，这为超低温保存PRP提供了理论基础。本试验不足之处，未对超低温保存PRP的功能进行监测，在今后工作中我们将持续观察研究超低温保存对PRP生长因子的影响，为PRP超低温保存的有效性提供更有力的证据。

研究表明PRP具备良好的抗菌功效[15]，本研究观察到16例患者在治疗前创面细菌培养阳性，经过治疗后仅有2例细菌培养阳性者，前后对比有显著差异，也印证PRP的抗感染效果。国外有学者报道，PRP被激活后释放多种抗菌肽[16]，有效辅助感染性创面的愈合。近年来，体外抑菌试验表明[17]，PRP凝胶（PLG）的抑菌作用最为明显，4 h内有效抑制细菌生长，为难愈性创面提供修复环境。

综上所述，血细胞分离单采制备PRP在难愈性创面的应用有着独特的优势和疗效，可以根据患者的实际情况拟定治疗方案，并且保证质和量，值得临床推广。