固相萃取-液相色谱-质谱法检测水产养殖水中的孔雀石绿及其代谢物、氧氟沙星、恩诺沙星和土霉素微量残留

郭伟伟，孙志洪

(1. 沧州市生态环境监控中心，河北 沧州 061000; 2. 河北省沧州生态环境监测中心，河北 沧州 061000)

0 引 言

我国是全球水产养殖大国，水产养殖业是我国农业产品贸易的优势产业，现已成为我国农业产品贸易发展的稳压器。水产养殖业在我国发展历史十分悠久，早在北宋时期我国就有开展水产养殖的记载，水产养殖主要有淡水养殖、海水养殖和循环水养殖3种，其中淡水养殖在我国南、北方地区均大量存在，淡水养殖水产品种主要有：鲫鱼、鲈鱼、虾、蟹等品种，均是我国老百姓餐桌上的美食[1-3]。水产品在养殖的过程中，为提高单位养殖密度和减少病虫害，养殖户常在养殖过程中使用抗生素、杀菌剂等，近些年，随着水产养殖业的集约化、规模化等的发展，水产养殖行业出现了一些被老百姓关注的问题，如抗生素超标、重金属超标等现象时有发生[4-8]。孔雀石绿是一种三苯甲烷类工业染料，氧氟沙星、恩诺沙星和土霉素等抗生素，因其价格便宜，且具有杀菌、消毒的作用，因此在水产养殖过程中常有使用。人们误食用被该类药物污染的水产品时，会导致体内抗生素残留增加，尤其对婴幼儿影响较大，轻者产生耐药性，重者可能导致药物中毒[9-12]。因此，加强对水产养殖水中的孔雀石绿及其代谢物、氧氟沙星、恩诺沙星和土霉素的监测，可以有效保护水产养殖用水资源、合理指导水产养殖业发展。

现阶段，许多学者针对地表水和水产品中孔雀石绿、氧氟沙星等进行了研究，如：王金秀、任兰正等研究了离子液体萃取-分光光度法测定水样中的孔雀石绿残留的分析方法[13]，冯涛、邬玲玲等研究了高效液相荧光法测定养殖水产中恩诺沙星等四种氟喹诺酮类药物残留[14]，关于水产养殖用水中孔雀石绿及其代谢物、氧氟沙星、恩诺沙星和土霉素微量残留的研究不多，其中分光光度法和液相色谱法专属性较差、且灵敏度偏低，不适用于水产养殖用水中极微量药物残留的监测。实验研究一种采用固相萃取提取、净化水产养殖用水中孔雀石绿及其代谢物、氧氟沙星、恩诺沙星和土霉素残留，液相色谱-质谱法定量、定性检测的分析方法[15]，实验证明，此方法灵敏度高、重复性好，可以用于水产养殖用水中孔雀石绿及其代谢物、氧氟沙星、恩诺沙星和土霉素残留的监测。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

岛津LC-30A型超高压液相色谱仪（日本SHIMADZU公司）；LCMS-8030型三重四级杆串联质谱仪（日本 SHIMADZU公司）；博纳艾杰尔Qdaura SPE-40型全自动固相萃取仪（天津Agela Technologies公司）；梅特勒ME 203E型电子天平（万分之一，瑞士mettler-toled公司）；L-148型水浴氮吹仪（北京来亨科技公司）；沃特世HLB固相萃取柱（规格：500 mg，12 mL，美国 Waters公司）；QL-901型涡旋振荡器（上海书培实验设备公司）；Milliplus 2150型超纯水系统（美国millipore公司）。

孔雀石绿标准溶液：编号为1ST7301-100M，浓度为100 µg/mL；隐色孔雀石绿标准溶液：编号为1ST7303-100M，浓度为 100 µg/mL；氧氟沙星标准溶液：编号为 BWQ8055-2016，浓度为 100 µg/mL；恩诺沙星标准溶液：编号为1ST4107-100M，浓度为100 µg/mL；土霉素标准溶液：编号为 1ST4111-100M，浓度为100 µg/mL，均购自北京北方伟业计量技术研究院。

乙酸铵、甲酸：分析纯，含量均大于99.0%，购自国药集团上海化学试剂厂；甲醇、乙腈：色谱纯，含量均大于99.999%，购自美国天地试剂公司；实验所有用水均为超纯水。

1.2 溶液制备

1.2.1 标准储备溶液的制备

取孔雀石绿标准溶液（浓度为100 µg/mL），准确移取1.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，得孔雀石绿标准储备溶液（浓度为10 µg/mL）；同法取隐色孔雀石绿、氧氟沙星、恩诺沙星和土霉素标准溶液，制备隐色孔雀石绿、氧氟沙星、恩诺沙星和土霉素标准储备溶液（浓度均为10 µg/mL）。

1.2.2 系列标准溶液的制备

分别取1.2.1孔雀石绿、隐色孔雀石绿、氧氟沙星、恩诺沙星和土霉素标准储备溶液，精密吸取适量，置同一支50 mL容量瓶中，加甲醇制备每1 mL溶液含有孔雀石绿、隐色孔雀石绿、氧氟沙星、恩诺沙星和土霉素分别为 0.002，0.02，0.2，1.0，2.0，4.0 µg的混合标准溶液，即得系列标准曲线溶液。

1.2.3 样品溶液的制备

样品收集：随机在水产养殖厂采集水产养殖水样2 L，过滤，去除肉眼可见异物，置棕色容量瓶中，储存条件4 ℃，该溶液在24 h内有效。

前处理：取收集后的水样，调节水样温度至室温，加0.1 mol/L氢氧化钠或盐酸溶液，调节pH值至7.0，然后将该水样倒入固相萃取仪样品储存瓶中，置样品架上；另取HLB固相萃取小柱，按设定的样品位置，将固相萃取小柱依次置固相萃取仪中，首先将固相萃取小柱进行活化（分别用12 mL纯化水、12 mL甲醇和12 mL正己烷活化萃取小柱）；设定程序，将上述水样 1 L，以 15 mL/min 的流量，过固相萃取柱，最后用15 mL 50%甲醇洗脱，收集洗脱液；最后将洗脱液氮吹至近干（45 ℃条件），再加甲醇定容至1 mL，混匀，即得。

1.3 色谱和质谱条件

1.3.1 色谱方法

色谱柱：Waters Acquity BEH UPLC-C18（规格：100 m × 2.1 mm, 2.1 µm）；柱温度：35 ℃；柱流量：0.25 mL/min；进样体积：10 µL；流动相 A：0.1% 甲酸的水溶液，流动相B：1 mmol/L乙酸铵的甲醇溶液；洗脱模式：梯度洗脱。洗脱表见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.3.2 质谱方法

扫描方式：ESI+正离子模式；离子源：电喷雾离子源；电喷雾电压：4500 V；离子源温度：560 ℃；离子传输管温度：350 ℃；辅助气压力：72 psi(1 psi=6.895 kPa)；气帘气压力：31 psi；碰撞气：氮气（氮气发生器制备）；检测模式：MRM（多反应监测模式）。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的确定

水样中兽药和禁用药物残留监测的前处理方法主要有：QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)净化法、凝胶净化色谱法和固相萃取法等。QuEChERS净化法，需要将水样进行浓缩后进行提取和净化，浓缩过程易造成目标物的损失或分解，准确度偏低；凝胶净化色谱法，前处理色谱条件需要优化，操作步骤繁琐，试剂耗用量大，且仪器价格较高，方法适用性较差；固相萃取法，无需对样品进行浓缩，且操作步骤简单，准确度较高，方法更易推广使用。实验取孔雀石绿、隐色孔雀石绿、氧氟沙星、恩诺沙星和土霉素加标浓度均为0.05 µg/mL的混合溶液，分别采用上述3种方法进行前处理，保持其他条件不变，考察3种前处理方法对检测结果准确度的影响。结果，凝胶净化色谱法和固相萃取法回收率优于QuEChERS净化法，考虑到固相萃取法的优势，最终确定固相萃取法为前处理方法。比较结果见表2。

表2 3种前处理方法回收率比较

2.2 固相萃取柱类型的确定

固相萃取柱在整个前处理过程中，对目标物的富集、净化、洗脱起到关键作用，因此选择适合的固相萃取柱，可以有效提高检测结果的准确度、降低基质干扰等。孔雀石绿、隐色孔雀石绿、氧氟沙星、恩诺沙星和土霉素5种目标物，其中孔雀石绿、隐色孔雀石绿极性较弱，氧氟沙星、恩诺沙星和土霉素极性均偏中等强度。实验分别选择HLB固相萃取柱、MCX固相萃取柱、C18固相萃取柱和氨基固相萃取柱（规格均为 500 mg，12 mL），保持其他条件不变，分别更换上述4种类型固相萃取柱，考察对孔雀石绿、隐色孔雀石绿、氧氟沙星、恩诺沙星和土霉素加标浓度均为0.05 µg/mL的混合溶液的回收率影响。结果如表3，选择HLB固相萃取柱时，5种目标物回收率最佳。因此实验选择HLB固相萃取柱作为前处理小柱。

表3 4种固相萃取柱回收率比较

2.3 质谱条件的优化

取1.2.1孔雀石绿、隐色孔雀石绿、氧氟沙星、恩诺沙星和土霉素标准储备溶液，分别配制质量浓度为150 ng/mL的单标测试溶液。分别将上述单标测试溶液，选择仪器模式为质谱模式，找到5种目标物的母离子，再以合适的碰撞能量将母离子击碎，得到母离子对应的子离子，选择响应较高的1个子离子作为定量离子，另选1个子离子作为定性离子，根据母离子对应的2个子离子对，优化碰撞能量和去簇电压，建立上述5种目标物的MRM监测方法。优化后的质谱条件见表4。

表4 质谱参数结果

2.4 标准曲线及检出限

取 1.2.2 项下 0.002，0.02，0.2，1.0，2.0，4.0 µg/mL的系列标准溶液，按1.3色谱和质谱条件，分别进样上述系列标准溶液，每个浓度点测定3次，取平均值，再以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，计算回归方程；最后逐级稀释标准溶液，以3倍信号噪音比值计算检出限。结果见表5，典型谱图见图1。

表5 标准曲线、回归方程及检出限

图1 典型质谱图

2.5 回收率试验

取水产养殖水样品（样品&3，本底中恩诺沙星含量为0.039 µg/mL），过200目筛网，去除肉眼可见异物，分别加入适量1.2.1孔雀石绿、隐色孔雀石绿、氧氟沙星、恩诺沙星和土霉素标准储备溶液，再加0.1 mol/L氢氧化钠或盐酸溶液，调节pH值至7.0，后续按1.2.3样品溶液处理方法进行，制备含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、氧氟沙星、恩诺沙星和土霉素浓度分别为 0.002，0.02，2.0 µg/mL 的加标溶液，再按1.3色谱和质谱条件，分别进样上述加标溶液，每份加标溶液制备5份，扣本底后计算回收率和RSD。结果见表6。

表6 回收率试验结果

2.6 方法重复性试验

取水产养殖水样品，过200目筛网，去除肉眼可见异物，分别加入适量1.2.1孔雀石绿、隐色孔雀石绿、氧氟沙星、恩诺沙星和土霉素标准储备溶液，再加0.1 mol/L氢氧化钠或盐酸溶液，调节pH值至7.0，后续按1.2.3样品溶液处理方法进行，制备含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、氧氟沙星、恩诺沙星和土霉素浓度为0.01 µg/mL的重复性溶液，同法制备6份，再按1.3色谱和质谱条件，分别进样上述重复性溶液，计算检测结果的RSD。结果，孔雀石绿、隐色孔雀石绿、氧氟沙星、恩诺沙星和土霉素重复性RSD均在5.0%以内，结果表明方法具有良好的重复性。

2.7 实际样品的测定

随机在水产养殖厂采集水产养殖水样5份，置棕色容量瓶中带回实验室，按1.2.3样品溶液处理方式进行，制备样品溶液，每份样品制备3份，再按1.3色谱和质谱条件，分别进样分析，计算5份不同样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、氧氟沙星、恩诺沙星和土霉素的含量。结果见表7。

表7 实际样品检测结果

3 结束语

实验以水产养殖水为研究对象，结合近年来水产养殖特点，针对孔雀石绿、隐色孔雀石绿、氧氟沙星、恩诺沙星和土霉素5种目标物，建立了采用固相萃取法提取、净化、洗脱水产养殖水中的上述5种目标物，液相色谱-质谱法定量、定性检测的分析方法。对方法的前处理方法和固相萃取柱类型进行了确定，考察了方法的线性等参数，并根据创建的方法对水产养殖水进行了检测应用，实验结果证明，此方法检出限低、操作步骤简单、检测结果准确，适用于水产养殖水中极微量杀菌剂、抗生素等残留的检测。