饥饿对眼斑双锯鱼幼鱼形态特征的影响

王海山，叶 乐，陈 治，杨超杰，胡清雨

（1.海南热带海洋学院水产与生命学院，海南三亚 572022；2.教育部热带海洋生物资源利用与保护重点实验室，海南三亚 572022）

鱼类的形态是其重要的特征，在鱼类育种工作中通常将某些形态指标作为重要的选育指标［1］，因此，采集鱼类形态特征信息是鱼类生态调查和育种的重要基础工作。图像分析系统的发展促进了形态测量法的发展和多样化，并扩大了使用形态测量法作为种群识别工具的潜力；使用多元技术，如主成分和判别分析来量化形态变量，在种群识别方面也受到越来越多的关注［2］。研究表明，由于生境［3-4］、性别［5-6］、生长发育阶段［7-9］等方面的不同，鱼类形态信息存在着种内差异。在自然生境中，鱼类常受到饥饿的胁迫，饥饿会影响鱼类生长、生理、代谢、行为等方面，这些研究目前已经较多见［10-12］，而饥饿对鱼类形态特征影响方面的研究相对匮乏［13］。

眼斑双锯鱼（Amphiprionocellaris）俗称公子小丑，属海葵鱼亚科（Amphiprioninae），是重要的海水观赏鱼种类之一。小丑鱼人工繁殖已经可以大规模实施，但许多研究工作尚未开展。目前国内对于眼斑双锯鱼的报道仅见胚胎发育［14-15］、营养［16-17］和药物应激生理［18］等方面，国外则多聚焦于性转化［19］、领域行为［20］和热应激［21］等问题，而饥饿对眼斑双锯鱼形态性状影响还未见报道。在生态调查和人工养殖中，鱼类的营养状况调查非常重要。特别在人工养殖过程中，由于投饵不足或饵料适口性和营养未能满足鱼类需求会使鱼类处于长期饥饿状态，容易引发疾病，导致鱼类大量死亡。通过鱼类饥饿状态判别可以推断前一段时间投喂量是否适当，饲料营养是否合理，有助于改进养殖措施。但目前对鱼类饥饿营养状态判断往往仅凭个人经验，没有在生产上适用的量化指标。因此，本研究通过图像分析软件采集数据，运用t检验、聚类分析、因子分析和判别分析，研究饥饿对眼斑双锯鱼幼鱼形态性状变异的影响，旨在揭示饥饿和非饥饿条件下眼斑双锯鱼主要形态性状的差异，通过量化指标评估其饥饿状态，为眼斑双锯鱼的生态调查和人工养殖提供参考资料、奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 实验对象与处理方法

实验于2019年12月在海南热带海洋学院实验室进行。实验鱼购自海南万宁小丑鱼繁殖场，选取同一批亲鱼产卵孵化培育60 d的健康幼鱼180尾，打包充氧带回实验室，在实验室循环水系统中暂养，7 d后随机分到60 cm×40 cm×40 cm玻璃养殖缸中。实验设饥饿组和对照组，每组30尾，设3个平行。对照组正常投喂（与暂养时一致），每日投喂2次配合饲料（佛山市顺德区全兴水产饲料有限公司生产的顶旺牌石斑鱼配合饲料0＃料），日按体质量1%～2%投喂，根据摄食情况调节，饥饿组不投喂，其余养殖条件一致。暂养和实验均为循环水养殖，每天采用7 w LED灯光照12 h，水温25～26℃。实验进行7 d，实验结束后全部取样，然后用MS-222麻醉剂将鱼麻醉后进行拍照和体质量测定。

1.2 数据测量和分析方法

用吸水纸吸干鱼体表水分后用精度为0.001 g的电子天平测量体质量（W，g），然后在体视显微镜下对每条鱼进行正反面拍照，用Image-Pro plus 6.0软件准确测量每条幼鱼的形态性状，包括全长（TL）、体长（SL）、体高（BD）、头长（HL）、头高（HD）、吻长（SnL）、尾柄长（CL）、尾柄高（CD）、背鳍前距（PDL）、胸鳍前距（PPL）、腹鳍前距（PVL）、臀鳍前距（PAL）、眼径（ED）、瞳孔直径（PD）等14个指标，精确至0.001 mm。

测量的形态性状指标如图1所示，为减少操作误差，所有样品鱼的测量指标由2人分别测定，每人对鱼体左右侧所有指标各测定1次，综合两人测定的4组数据取平均值作为最终数值用于统计。

图1 形态指标测量示意图Fig.1 Schematic diagram of morphological index measurement

计算各性状的平均值和标准差，进行独立样本t检验。各性状变异系数（CV）的估计公式：CV=（标准差／平均值）×100%；肥满度（K）计算公式：K=（W／L3）×100%。

为消除鱼体大小差异的影响，将可量性状参数转化为比值参数，取全长／体长（TL／SL）、体长／体高（SL／BD）、体长／头长（SL／HL）、体高／头高（BD／HD）、头长／吻长（HL／SnL）、体长／尾柄长（SL／CL）、尾柄长／尾柄高（CL／CD）、体长／背鳍前距（SL／PDL）、体长／胸鳍前距（SL／PPL）、体长／腹鳍前距（SL／PVL）、体长／臀鳍前距（SL／PAL）、体高／尾柄高（BD／CD）、头长／眼径（HL／ED）、头长／瞳孔（HL／PD）共14个形态比值参数。对未经处理的形态性状、体质量、肥满度和形态比值参数等数据进行独立样本t检验，当P＜0.05时，表示参数在两组之间差异性显著，当P＜0.01时，表示参数在两组之间差异性极显著。分别将所有试验鱼的14项形态性状和14个比值数据，用IBM SPSSstatistics25进行聚类分析、因子分析和判别分析。聚类分析采用系统聚类法；因子分析采用主成分提取，最大四次方值法（quartimax method）进行旋转；判别分析采用Wilks’Lambda步进法，获得未标准化判别方程。

2 结果与分析

2.1 可量性数据和比值数据t检验

对眼斑双锯鱼幼鱼体质量和形态性状数据t检验结果见表1。结果显示，饥饿组和对照组除了尾柄高有显著差异外（P＜0.05），其余形态性状包括体质量和肥满度均未达到显著性差异水平（P＞0.05）。形态比值参数数据t检验结果见表1。结果显示，TL／SL、SL／BD、SL／HL、BD／HD、HL／SnL和SL／CL等6个参数在饥饿组和对照组间无显著性差异（P＞0.05）；CL／CD在两组之间差异性显著（P＜0.05）；SL／PDL、SL／PPL、SL／PVL、SL／PAL、BD／CD、HL／ED和HL／PD等7个参数在两组之间差异性极显著（P＜0.01）。

表1 表型性状和形态比值数据的t检验结果Tab.1 t-test results of measurable traits and morphological ratio data between starvation and control group

2.2 聚类分析

分别对所有试验鱼的形态性状数据和比值数据进行系统聚类分析表明，对2类数据进行的系统聚类分析可以将全部试验鱼分为2大类，分别包含饥饿组和对照组鱼类。

2.3 因子分析

对直接测量获得的形态性状数据进行因子分析结果见表2，只获得1个主成分。该主成分对变异的方差贡献率较大（77.478%），包含了群体总变异的大部分。对主成分的因子负荷矩阵进一步分析，发现主成分1在全部形态性状的载荷值均大于0.5，即主要反映整体形态的变化，不能具体分析主要差异在哪。强行提取3个主成分并运用主成分1、2和3成分得分系数绘制三维立体图，结果如图2-a所示。由图2-a可见，饥饿组和对照组群体分布区域绝大部分重叠，不能分开。

表2 形态性状数据的载荷矩阵及主成分对总变异的贡献率Tab.2 Loading matrix of morphological data and contribution rate of principal components to total variation

对形态比值参数进行因子分析共获得4个主成分，综合指标分析结果见表3。4个主成分对变异的方差贡献率较大，分别为25.625%、21.836%、16.005%和9.233%，累积贡献率为72.689%，这4个主成分包含了群体总变异的大部分。对主成分的因子载荷矩阵进一步分析，发现主成分1在SL／HL、SL／PDL、SL／PPL和SL／PVL的载荷值均大于0.7，即主要反映头长和各鱼鳍相对位置的变化；主成分2在HL／PD上载荷值较大（载荷值＞0.9），主要反映鱼头部和瞳孔之间的形态变化；主成分3在CL／CD和BD／CD的载荷值较大（载荷值＞0.6），主要反映尾柄部位的形态变化；主成分4在BD／HD的载荷值较大（载荷值＞0.6），主要反映头部高度的形态变化。从主成分1、2、3和4可见，2个实验群体的鱼在形态上的差别主要是由鱼头部形态、各鱼鳍相对位置和尾柄部位差异引起。运用主成分1、2和3成分得分系数绘制三维立体图，结果如图2-b所示。由图2-b可见，饥饿组和对照组群体只有极少量重叠区域，绝大部分可以分开。

图2 利用形态性状（A）和形态比值数据（B）进行因子分析的主成分三维图Fig.2 Three dimensional principal component diagram of factor analysis for morphological data（A）and morphological ratio data（B）

表3 形态比值参数数据的载荷矩阵及主成分对总变异的贡献率Tab.3 Loading matrix of morphological ratio parameter data and contribution rate of principal components to total variation

2.4 判别分析

对形态性状数据进行经判别分析筛选得到贡献最大的4个参数，分别为PDL、PPL、PVL和PAL，据此构建未标准化典则判别函数方程Y1=-3.010+2.144PDL-2.243PPL-1.068PVL+0.994PAL。饥饿组Y1平均值为-1.385，对照组Y1平均值为1.157；对形态比值数据进行经判别分析筛选得到贡献最大的3个参数，分别为BD／HD、HL／ED、HL／PD，分别以X1、X2、X3表示，据此构建未标准化典则判别函数方程Y2=-8.224 5+0.265X1-1.852X2+2.174X3。饥饿组Y2平均值为-8.245，对照组Y2平均值为6.887。判断某尾鱼的群体是否为饥饿状态时，将所测数据代入方程，获得的函数值与哪组平均值更接近即为其所属状态。上述2个函数的威尔克Lambda显著性P＜0.01，表明均有统计学意义。

为了验证上述判别方程的实用性，对建立的判别方程进行预测分析和统计评价，判别结果见表4。结果可见，由形态性状数据建立的方程，饥饿组中有8尾误判到对照组中，判别正确率为90.00%，对照组中有7尾误判到饥饿组中，判别正确率为91.25%；而使用形态比值数据建立的方程，饥饿组和对照组判别准确率均为100.00%，交互验证结果证明使用形态比值数据建立的判别函数可信度高于使用形态性状数据建立的方程。

表4 对照组和饥饿组试验鱼的判别验证结果Tab.4 Discrimination results for judging A.ocellaris starving status

3 讨论

3.1 鱼类饥饿形态性状变异

鱼类形态性状存在种间差异［22］，也存在种内差异。已有研究表明，引起种内形态差异的原因有不同地理居群的形态分化［23］、性别［5］、不同生长发育阶段［8-9］和环境因素［3-4，24-25］。自然环境中的饵料缺乏以及养殖过程中饵料投喂不当等常导致鱼类处于饥饿的胁迫状态，研究发现，饥饿对鱼类形态特征存在显著影响，如中华倒刺鲃（Spinibarbussinensis）仔鱼随着饥饿程度增加，体长和体高均显著下降［26］；饥饿时牙鲆（Paralichthysolivaceus）前后体轴相关的形态性状数值下降，头部形态特征的经典尺寸（classical dimensions）显著增大［27］；鲤（Cyprinuscarpio）幼鱼饥饿后体高明显下降，导致体高／体长明显下降，体型变得更加“细长”［13］；本研究与之不同的是，本研究中7 d的饥饿胁迫并没有对眼斑双锯鱼幼鱼形态和体质量指标产生显著影响，这可能与种间差异和饥饿胁迫的时间还不足够长有关，但大多数形态比值在饥饿组和对照组之间已出现显著差异，因此本研究证实了饥饿胁迫确实对鱼类的形态性状特征造成了影响，形态参数可作为一个衡量鱼类饥饿状态的有效指标。

3.2 鱼类形态测量分析技术

传统鱼类形态测量方法为尽可能的减少人为误差，加大了取样数量，增加了工作量，测定时鱼类离水时间过长难免造成鱼类死亡。因此本研究摒弃传统游标卡尺现场测定的方法，采用较先进的图像分析技术，用麻醉剂将鱼麻醉后拍照，再用电脑软件分析，精确度高，而且对于同一批实验样本，采用2人测定正反面数据取平均值再统计，进一步消除了人为误差，使得结果更为可信。

因子分析是一种多元统计方法，已广泛应用于各个领域的调查和分析，如：1）地理种群区分：杨琴等［23］运用主成分和判别分析发现，影响凤鲚（Coiliamystus）群体形态差异的主要因素在躯干部和尾部，并且构建了4个群体的判别方程；KARTAVTSEV等［28］通过形态计量学性状的因子分析和判别分析发现，太平洋鲱鱼（Clupea pallasii）本地种群具有明显生物学意义的3个分化群存在；2）鱼类的行为和环境分析：QUEIROZ等［29］通过几何形态测量方法发现，松鲷（Lobotes surinamensis）、圆眼燕鱼（Plataxorbicularis）和疣鳞鲀（Canthidermismaculata）3种鱼的几何形态与其伴生植物的几何形态具有较强的相关性；3）群落结构分析：BAGHERI等［30］运用主成分分析揭示了网箱养殖对浮游动物丰度的影响；4）性别判别：武兆文等［6］运用主成分分析发现，雌雄杂交黄颡鱼的差异主要集中在肥满度及外部轮廓指标上，并建立了性别判别函数。本研究采用因子分析和判别分析，尝试对鱼类的饥饿状态进行评估。结果表明，与t检验方法相比，因子分析和判别分析可以更清晰地揭示变异的主要因素。t检验未发现7 d饥饿对体质量、肥满度和大部分形态性状参数造成显著影响，而对8个形态性状比参数（CL／CD、SL／PDL、SL／PPL、SL／PVL、SL／PAL、BD／CD、HL／ED和HL／PD）则均有显著影响，导致无法判断主要变异因子具体为哪些可度量参数。因此，进一步的因子分析通过提取主成分和旋转矩阵，而获得较清晰的形态变异因子，揭示其主要变异由鱼头部形态、各鱼鳍相对位置和尾柄部位引起。而进一步经判别分析得出的饥饿状态的未标准化典则判别方程，通过检验发现将所测相关数据代入方程即可有效快捷地评估鱼类的饥饿状态。除未标准化方程以外，还有标准化方程，而标准化方程需要将所测数据进行标准化处理再代入方程中才能计算。本研究选取的未标准化方程则可直接将测量数据代入方程中计算，不需标准化处理，相比标准化方程更加方便快捷。