抑肝散活性成分治疗阿尔茨海默病伴发抑郁障碍的网络药理学研究

赵 驰，郭蓉娟，任非非，于 姚，李俊男，李 阳

（1. 北京中医药大学，北京 100029；2. 北京中医药大学东方医院，北京 100078；3. 首都医科大学附属北京中医医院，北京100010）

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是以进行性认知功能障碍为主要特征的常见中枢神经系统退行性疾病，是65 岁以上人群致残的主要原因［1，2］。在AD 进 程 中 可 以 出 现 不 同 程 度 的 精 神 障碍，抑郁障碍是常见的共病性精神障碍之一。流行病学研究表明，近40%的AD 患者会在痴呆进展过程中出现抑郁障碍［3］，且AD 患者出现持续性抑郁障碍的比例很高，约30%～85%，而常规的抗抑郁药物对于AD 患者伴发抑郁治疗效果不佳［4］。

抑肝散首载于明代名医薛铠所著的《保婴撮要》中，原方由柴胡、钩藤、当归、川芎、甘草、茯苓、白术组成，具有平肝解痉、健脾养血之功。日本汉方医学将抑肝散用于治疗痴呆的精神行为症状（behavioral and psychological symptoms of dementia，BPSD）［5］。国内中医学者也多将其用于神经系统、消化系统疾病的治疗［6，7］。基础研究表明，抑肝散能够抑制β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）的形成，并且能够抑制谷氨酸介导的兴奋性毒性作用，同时可以不同程度地提升老年大鼠前额叶皮质的5-羟 色 胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）及 多 巴 胺（dopamine，DA）水平，从而发挥改善认知、抗抑郁、抗焦虑及神经保护等作用［8，9］。

网络药理学的概念最先由Hopkins［10］在网络生物学及系统药理学的基础上提出，中药复方富含的化学成分能够针对不同靶点，网络药理学研究从中药成分、靶点与疾病靶点之间的相互作用出发，可在一定程度上揭示中药复杂的作用机制及调控网络［11］。本研究采用网络药理学方法，探讨抑肝散活性成分对AD 伴发抑郁障碍的作用靶点及信号通路，阐明其可能的治疗机制以及复方功效与活性成分的生物相关性，为进一步明确中药抗痴呆、抗抑郁疗效及临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 抑肝散化学成分收集及筛选

通过TCMSP 数据库（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/index.php，Version 2.3）对抑肝散中的7 味中药进行检索，筛选条件为口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug-like，DL）≥0.18，血脑屏障（blood brain barrier，BBB）≥-0.3，并通过查阅文献，纳入筛选标准以外但具有明确生物活性及药理作用的化学成分。

1.2 抑肝散靶点预测

将筛选后的活性化合物通过PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）进行检索并校对，存储化合物的2D 结构，通过Swiss Target Prediction 服 务 器（http：//www.swisstargetprediction.ch/）进行反向靶点预测。通过UniProt 数据库（http：//www.uniprot.org/，Update in 2014-04-10）对蛋白靶点进行校正。

1.3 疾病靶点预测

通过检索Genecards 数据库（https：//www.genecards.org/，Version 4.14）、OMIM 数据库（https：//omim.org/，Update in 2020-05-08）、PharmGkb 数据库（https：//www.pharmgkb.org/）获得AD 及抑郁障碍的靶点基因。

1.4 网络构建及分析

使用Cytoscape-v3.7.2 构建药物-活性成分-靶点网络和活性成分-靶点-疾病网络，并进一步分析网络中各节点的属性及联络关系。

1.5 靶点的基因富集分析和代谢通路分析

利用R 语言对交集基因进行GO terms 及KEGG pathway 富 集 分 析，使 用clusterProfiler 包［12］进行分析，分别对GO 生物学过程及KEGG 通路进行分析，设定P≤0.01，选取前20 位的结果，运用enrichplot 包进行可视化。

1.6 PPI 分析

蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）信息有助于挖掘抑肝散重要药效团及效用靶点，将抑肝散治疗AD 伴发抑郁的作用靶点上传至String数据库（https：//string-db.org/）以获取蛋白相互作用信息［13］，运用Cytoscape 软件绘制PPI 网络图并进行分析。运用MCODE 插件进一步对PPI 网络进行模块化分析，得到Cluster 模块分析结果。

1.7 AutoDock Vina 分子对接

AutoDock Vina 主要用于结构生物学、蛋白质功能等方面的研究，可以预测重要活性成分与蛋白受体的结合性。将PPI 网络中作用关系较为复杂的靶蛋白作为分子对接的受体，从蛋白质晶体结构数据 库PDB（http：//www.rcsb.org/）中 获 取 目 标 蛋白，利用AutoDock Vina 进行分子对接，对接结果通过PyMOL 进行可视化。

2 结果

2.1 抑肝散活性成分筛选

基于TCMSP 数据库检索结果，共收集到1 097个活性化合物，对化合物的OB、DL、BBB 参数进行筛选，并通过查阅文献进行补充。对于筛选标准以外的如山奈酚、槲皮素［14］、阿魏酸［15］、藁本内酯［16］、白术内酯［17］等经文献报道具有抗抑郁或抗痴呆等药理作用的化合物也纳入候选活性成分，最终共得到活性成分125 种。见表1。

表1 抑肝散活性成分基本信息表Tab 1 Active ingredients of Yigan Powder

续表

2.2 抑肝散靶点预测

基于Swiss Target Prediction 平台反向靶点预测结果，得到抑肝散活性成分的相关人源靶点蛋白，筛选probability＞0 并去除重复靶点，利用UniprotPKB 检索功能进行校正并转换为经验证的人源靶点，最终得到预测靶点基因953 个。

2.3 疾病靶点采集

基于GeneCards、OMIM、PharmGKB 数据库的检索结果，共得到AD 相关基因1 016 个，抑郁障碍相关基因1 248 个。将抑肝散预测靶标映射至疾病靶标中，并绘制韦恩图（图1），953 个预测靶标中有166 个与AD 密切相关，179 个与抑郁障碍密切相关，其中85 个基因同时涉及两种疾病，是抑肝散治疗AD 伴发抑郁障碍的重要靶点。

图1 靶标韦恩图Fig 1 Venn diagram of targets of Yigan Powder-Alzheimer's disease-depressive disorder

2.4 网络构建与分析

2.4.1 活性成分-预测靶点网络 将抑肝散的125种活性成分和953 个预测靶点信息导入Cytoscape软件，据相互作用关系构建药物-活性成分-预测靶点网络（图2），节点（node）表示活性成分及预测靶点，边（edge）表示活性成分与预测靶点之间的联系。对活性成分-预测靶点网络进行分析，该网络由1 081 个节点及8 591 条边构成，平均每个节点与15.895 个节点相关联，125 个活性成分中，有45 个活性成分对应靶点超过100 个，可能是抑肝散的主要效用成分，其中31 个活性成分来自甘草，10 个活性成分来自钩藤。

图2 药物-活性成分-靶点网络图Fig 2 Network of herbs-active ingredients-targets

2.4.2 活性成分-靶点-疾病网络 将125 个活性成分及与AD、抑郁障碍相关的潜在靶点构建活性成分-潜在靶点-疾病网络图（图3），网络分析参数中的度值（degree）是指与节点相联络的边的条数，活性成分的度值越高则表明该化合物相关联的靶点越多，对节点的颜色进行调节，度值越高的节点越接近红色，越低则越接近蓝色，该网络中有8 个活性成分度值大于40，以甘草及钩藤中的活性成分为主，其中涉及4 种黄酮类物质，2 种生物碱，可能是抑肝散治疗AD 伴发抑郁的重要活性成分（表2）。

表2 抑肝散靶点网络主要活性成分及节点信息Tab 2 Main active ingredients and degree in Yigan Powder target network

图3 抑肝散活性成分-疾病靶点网络图Fig 3 Network of active ingredients-disease targets

在85 个交集基因中，有60 个靶基因至少与5 个活性成分相连，靶点度值越高，则其与AD 合并抑郁障碍的相关性越高，其中度值前10 位的靶点涉及雌激素受体、诱导型一氧化氮合酶、单胺氧化酶、糖原合成激酶等（表3）。

表3 抑肝散靶点网络主要靶蛋白及节点信息Tab 3 Main target protein and degree in Yigan Powder target network

2.5 GO 富集分析及KEGG 通路富集分析

靶基因涉及的生物学过程主要包括认知、学习、记忆，神经递质的代谢、调节及转运，突触的传递及调节，MAPK 活性调节，胶质细胞再生及分化，活性氧的合成及代谢，钙离子稳态平衡等（图4）。KEGG 通路富集分析结果涉及AD 相关信号通路、神经活性配体-受体作用、多巴胺能神经元突触、5-HT 能 神 经 元 突 触、HIF-1 信 号 通 路、Rap 1 信 号 通路、癌症相关蛋白多糖、EGFR-TKI 耐药、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 系统信号通路等（图5）。其中，AD 相关通路包括氧化磷酸化、自噬、细胞凋亡、胰岛素信号通路、钙离子信号通路等，覆盖了核心靶点淀粉样前体蛋白（APP）、早老素（PSEN），涉及tau 蛋白磷酸化及神经元纤维缠结（NFTs），参与调节N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR），与神经元凋亡、自噬缺陷、线粒体功能障碍、神经递质缺陷、轴突运输障碍、突触可塑性受损和神经变性等病理过程密切关联（图6）。

图4 GO 生物学过程富集分析Fig 4 GO biological process enrichment analysis

图5 KEGG 通路富集分析Fig 5 KEGG pathway enrichment analysis

2.6 PPI 网 络 及Cluster 模 块 分 析

2.6.1 PPI 网络 将网络数据中Combined score≥0.9 的节点构建PPI 网络图，图中节点的面积和颜色与度值相关，边的颜色和粗细与Combined score 相关，67 个蛋白之间存在191 种相互作用关系（见图7）。其中，淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、信号传导与转录激活因 子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）等为PPI 网络的中心部分，涉及较多的蛋白相互作用，与抑肝散的效用机制密切相关。

2.6.2 PPI 网络Cluster 模块 使用Cytoscape 软件的MCODE 插件对PPI 网络进行Cluster 模块分析，共得到5 个Cluster 模块（图7）。进一步了解5 个Cluster 模块分别涉及的生物学功能，Cluster1 与突触信号传递过程高度相关，与钙离子信号通路及PI3k/Akt 信号通路密切相关；Cluster2 主要与谷氨酸受体活性和环腺苷酸（cyclic adenosine monophosaphate，cAMP）信号通路相关；Cluster3 与白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-17、活性氧（reactive oxygen species，ROS）生物合成相关，涉及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、Toll 样受体（toll-like receptor，TLR）信号通路、核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信号通路等多条炎症信号通路；Cluster4 与5-HT、DA 等神经递质代谢过程相关；Cluster5 与类固醇代谢有关。

2.7 AutoDock Vina 分子对接

采用AutoDock Vina 进行分子对接，将Wallichilide（川芎萘呋内酯）、7-Acetoxy-2-methylisoflavone（7-乙酰氧基-2-甲基异黄酮）作为配体，受体为PPI网络中度值较高的靶蛋白，包括APP、MAPK1、STAT3，以及治疗AD 和抑郁症的一线药物靶点蛋白乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AchE）、5-羟色胺转运蛋白（serotonin transporter，SERT），AchE的对照药物为盐酸多奈哌齐，SERT 的对照药物为艾司西酞普兰，利用PyMOL 软件将对接构象进行可视化（图8）。

图8 AutoDock Vina 分子对接可视图Fig 8 Results of AutoDock Vina molecular docking

2 种活性成分与5 种靶蛋白分别形成多种对接构象，选取结合能较低的结果作为分子对接结果（表4），结合能越小代表配体与受体蛋白结合性越好，Wallichilide 及7-Acetoxy-2-methylisoflavone 对5种靶蛋白均有较好的结合力，但是抑肝散活性成分与对照药物盐酸多奈哌齐及艾司西酞普兰相比，分子对接结合性与对照药物相比较差。

表4 分子对接结果信息Tab 4 Results of ligand-receptor molecular docking

3 讨论

阿尔茨海默病是一种复杂的神经系统退行性疾病，AD 与抑郁障碍均涉及多种发病假说，但共同存在神经递质水平下降、突触数量减少、脑源性神经 营 养 因 子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）水平下降、线粒体功能障碍、神经炎症等病理生理学特征［18］。中医自古便有“异病同治”的治疗观，中药复方又具有多成分-多靶点-多通路的特点，可以协同调控复杂的疾病网络。临床研究表明，抑肝散具有改善认知的作用，并且能够显著改善AD 患者的精神行为症状［19］，在常规治疗基础上联用抑肝散可以减少抗精神病药物的剂量［20］，提示抑肝散具有较好的抗痴呆、抗抑郁疗效。

本研究基于数据库及网络分析，发现抑肝散干预AD 伴发抑郁障碍与125 个主要活性成分相关，靶点预测和网络分析结果表明APP、MAPK、ESR、MAO、GSK3B 等靶点在抑肝散的药理功能中起关键作用。APP 在人体内经蛋白酶裂解后便产生Aβ，最终引起突触功能障碍、神经炎症以及细胞死亡，是AD 的核心病理过程之一。MAPK 是一种广泛表达的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要由细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK），p38 和c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）组成，其中p38 居于重要地位，参与促炎信号转导并能调节细胞因子的合成，可引起不同程度的神经炎症，并涉及tau 蛋白过度磷酸化及细胞凋亡［21］。雌激素对记忆性胆碱能神经元具有保护作用，并且能够通过激活ESR 而抑制Aβ 的生成和累积，通过调节细胞骨架、蛋白转运等生物学过程，改善突触传递功能［22］，影响记忆、学习等多种行为过程。同时，雌激素应答可以提高DA 神经的敏感性并增加血清5-HT 的含量，在情绪障碍及认知障碍进程中发挥作用。MAO 是机体内参与单胺类物质代谢的主要酶类，参与5-HT、DA 等多种神经递质的分解过程。SRC 是NMDAR 酪氨酸磷酸化的主要酪氨酸激酶，通过介导NMDARs 磷酸化引起的谷氨酸能神经传递功能障碍及神经突触可塑性改变与AD 及抑郁障碍的病理生理过程有关［23］。GSK3B 参与tau 蛋白的磷酸化过程及神经原纤维缠结的形成，还能引起脑内Aβ 合成增加，诱发神经元凋亡，与AD 发病密切相关［24］。同时，抑肝散亦可作用于AchE 单独治疗AD，通过抑制AchE 的活性，增强胆碱能神经元突触间ACh 的水平及传递效能，达到改善AD 患者临床症状的目的。可见，抑肝散可以通过多种靶点和信号通路作用于中枢神经系统，发挥抗痴呆、抗抑郁、抗氧化、抗炎及神经保护等作用。

GO 富集分析结果表明，靶点关联的生物学过程主要涉及神经递质代谢，突触传递，MAPK 级联激活，钙离子稳态的调节等。通路富集分析的结果表明，靶点参与的通路主要涉及氧化磷酸化、细胞凋亡、钙离子信号通路等。神经递质代谢异常是AD 和抑郁症的共同病理生理学表现，抑肝散活性成分可以靶向调控AchE、SERT，改善脑内5-HT、ACh 等神经递质的代谢。MAPK 在应激等细胞外刺激的作用下，参与处理和调节多种细胞活动。有学者发现，在AD 早期阶段，中枢神经系统就存在p38 MAPK 的激活［25］，是AD 发生的重要机制之一，而ERK 可以与多种神经递质受体结合而诱发抑郁症状［26］。同时，抑制p38 MAPK 活性可以阻断NFκB 信号通路，减少IL-1β、IL-18 等致炎因子的释放，从而减轻神经炎症。由于代谢、氧化、应激等反应，受损的神经元细胞出现钙离子稳态失调会诱发Aβ聚集、tau 蛋白磷酸化、线粒体功能障碍等病理过程，最终影响学习和记忆［27］。钙离子稳态失调也会引起NMDAR 的过度激活，触发谷氨酸毒性反应，可以导致神经元细胞凋亡。抑肝散可以通过多种途径对钙离子信号通路进行调控，抑制tau 蛋白过度磷酸化，改善线粒体功能，抑制神经元细胞的凋亡［28］。PPI 网络可以观察蛋白间的相互作用及调控关系，抑肝散治疗AD 伴发抑郁障碍的PPI 网络结果显示APP、MAPK1、STAT3、SRC 等存在较多的蛋白互作关系，可能是抑肝散的关键效用靶点，主要参与调控神经递质、神经炎症及细胞凋亡等。

综上所述，本研究应用网络药理学方法，通过对中药复方和疾病靶点进行分析，发掘了抑肝散治疗AD 伴发抑郁障碍的复杂关系网络及潜在机制。研究结果表明了抑肝散的作用靶点、生物学过程及相关通路，不仅可以针对AD 的核心靶点，减轻Aβ的沉积，也能够起到减轻神经炎症、改善神经可塑性、调节神经递质代谢等作用，能够在一线药物的基础上改善AD 进程中出现的情绪障碍，与西药联用可以体现出较好的疗效，可以为AD 伴发抑郁障碍的治疗提供新思路，但其结果仍需相关研究进一步验证。网络药理学方法基于现有化合物的明确信息，不能完全明确化合物间的化学反应以及机体代谢过程出现的变化，亦需进一步深入研究抑肝散药效的物质基础及作用机制。

作者贡献度说明：

赵驰：本研究方案设计者和执行人，完成数据采集、数据分析、论文初稿写作及论文审阅等工作；郭蓉娟：指导研究设计及数据分析，对文章的知识性内容作批评性审阅；任非非：参与研究设计和结果分析，对文章内容进行审阅；于姚，参与数据采集，在统计分析方面提供一定技术支持；李俊男：参与文献查阅，指导论文修改；李阳：参与文献查阅，对文章内容进行审阅。