基于网络药理学的脉络舒通丸治疗痔疮作用机制研究Δ

翟弋焱,陈美琳,黄佳奇,时 锐,伍 超,张景媛,张繁芹,王 伟,程国良,李 冰,谭影影,黄志鸿,巫志姗,吴嘉瑞#(.北京中医药大学中药学院,北京 0009;.鲁南制药集团股份有限公司医学部,山东临沂 76005)

痔疮为临床常见的疾病,而且发病因素较为复杂,受到自身生理因素与外界环境因素的共同影响,同时该病复发率高,难以完全治愈[1]。国内流行病学调查结果显示,痔疮的发病率占肛肠类疾病的87.25%[2]。中医治疗痔疮的历史非常悠久。张仲景在《金匮要略》中已经记载,“先血后便,此近血也,赤小豆当归散主之”,提出了鉴别痔疮出血的方法以及对应的治疗方药。孙思邈的《千金要方》中记载了多首内治方药,如槐子丸、刺皮丸和内补散等,沿用至今也有明显疗效[3]。中医认为,痔疮主要是由久坐、久蹲、便秘、泻痢、情志失调和气血虚等因素影响脏腑功能,再加上风、湿、热等邪气下迫大肠阻滞于肛门从而产生[4]。中医对于痔疮的治疗主要为内治法与外治法。内治法以汤剂和中成药为主,多使用清热解毒、清热凉血、活血化瘀和清热燥湿类药物;外治法以散、膏、栓等剂型为主,直达病位进行治疗[5]。脉络舒通丸由黄芪、金银花、黄柏、苍术、薏苡仁、玄参、当归、白芍、甘草、水蛭、全蝎和蜈蚣12 味药组成,诸药配伍,共奏清热解毒、利湿消肿、化瘀通络之功,在临床常被用于治疗湿热瘀阻脉络之静脉血管血栓性疾病,但其治疗痔疮的具体作用机制尚不明确,值得深入研究。因此,本研究采用网络药理学方法,结合分子对接技术,探讨脉络舒通丸治疗痔疮的作用机制。

1 资料与方法

1.1 脉络舒通丸活性成分的筛选与靶点预测

使用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,http://tcmspw.com/),以“黄芪”“金银花”“黄柏”“苍术”“薏苡仁”“玄参”“当归”“白芍”“甘草”“水蛭”“蜈蚣”和“全蝎”为关键词检索脉络舒通丸中的化学成分。进行相关参数的设置:口服生物利用度(OB)≥30%,类药性(DL)≥0.18。同时检索中国知网、万方数据库、PubMed 等数据库中关于脉络舒通丸化学成分研究的文献,对脉络舒通丸的化合物进行补充。以上述操作筛选后的成分作为活性成分,使用Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)查询靶点蛋白对应的基因名称。

1.2 痔疮相关靶点的筛选

使用DisGeNET(https://www.Disgenet.org/search/) 和GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库,检索关键词为“hemorrhoids”,获得疾病基因,合并2 个数据库的结果,去除重复项后得到痔疮的相关靶点。

1.3 脉络舒通丸化学成分-靶点网络图的构建

使用Cytoscape 3.8.2 软件构建脉络舒通丸化学成分与相关靶点的成分-靶点网络图。根据度值、紧密度和介数等相关参数进行筛选得到关键的靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络图的构建与模块分析

对脉络舒通丸靶点与痔疮的靶点取交集,经过STRING 数据库(https://cn.string-db.org/)分析得到PPI 网络,将其导入Cytoscape 软件进行分析,利用MCODE 插件对PPI 网络进行模块分析。

1.5 基因本体(GO)功能富集分析与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

使用R 软件对模块分析后获得的脉络舒通丸治疗痔疮的关键基因进行GO 与KEGG 分析,再利用R 软件对其结果进行可视化。

1.6 分子对接

对PPI 网络中的介数、紧密度和度值3 个参数进行筛选得到8 个关键靶点,对这些靶点与其相对应的化合物进行分子对接。从PubChem 数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中获得这些化合物的SDF 格式文件,使用Chem 3D 19.0软件将其转变为pdb 格式文件。利用软件设置可旋转键与活动键时需要移动的最少的原子数目,将其保存为PDBQT 格式。蛋白质结构通过RCSB PDB 数据库(https://www.rcsb.org/)筛选获得,同时删除所获得蛋白质中的水分子、原小分子配体等。利用Autodock Tools 1.5.6 软件对蛋白质进行加电荷、加氢等操作,然后设置Grid Box 坐标与盒子大小。最后,使用Autodock Vina 1.1.2 进行运算对接。整理分析对接结果,根据结合能进行排序,选择结合能最低的对接结果使用PyMol 2.3.2 软件进行可视化处理。

2 结果

2.1 成分-靶点网络图

成分-靶点网络图包括525 个节点,3 121 条边,其中215个化合物和310 个靶点关联,见图1。

2.2 潜在靶点的PPI 网络图

对化合物的靶点与疾病的靶点取交集得到148 个交集靶点,制作韦恩图,见图2。将交集靶点通过STRING 网站进行分析,将结果导入Cytoscape 软件制作PPI 网络图,见图3。图3 中,每个节点的大小代表了其度值,颜色由浅到深代表了紧密中心由大到小;图中有143 个节点,1 835 条边。使用MCODE 插件进行模块分析,进行模块可视化,见图4。聚类得分高的模块意味着其中的靶点关系更密切,共同参与某种生物途径。

图2 脉络舒通丸与痔疮的交集靶点图Fig 2 Target map of intersection between Mailuo Shutong pills and hemorrhoids

图3 脉络舒通丸相关靶点PPI 网络图Fig 3 PPI network of Mailuo Shutong pills related targets

图4 脉络舒通丸治疗痔疮的PPI 网络模块Fig 4 PPI network module of Mailuo Shutong pills in the treatment of hemorrhoids

2.3 GO 功能富集与KEGG 通路富集分析

对PPI 网络与模块都进行GO 功能富集与KEGG 通路富集分析。对PPI 网络的分析共得到161 条KEGG 通路,3 041 条GO 功能条目。GO 功能条目中,包括2 706 条生物过程(BP)相关条目,140 条细胞成分(CC)相关条目,195 条分子功能(MF)相关条目,P值最低的10 个生物过程相关条目为对化学物质的反应、对有机物的反应、对生物质量调控、细胞对化学刺激的反应、多细胞生物过程的调控、细胞对有机物质的反应、对外部刺激的反应、对含氧化合物的响应、细胞群体增殖和对分子功能的正向调节;KEGG 通路富集分析中,P值最低的前20 条通路为癌症通路、脂质与动脉粥样硬化、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路、蛋白多糖与癌症、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号通路、乙型肝炎、化学致癌-受体激活、前列腺癌、晚期糖基化终末产物(AGE)-AGE 受体(RAGE)信号通路在糖尿病并发症中的作用、丙型肝炎、甲型流感、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药性、细胞凋亡、流体切应力与动脉粥样硬化、非小细胞肺癌、胰腺癌、癌症的中枢碳代谢、结直肠癌、子宫内膜癌及膀胱癌,见图5—6。

图5 脉络舒通丸治疗痔疮PPI 网络模块GO 和KEGG 富集分析结果Fig 5 GO and KEGG enrichment analysis of PPI network module of Mailuo Shutong pills in the treatment of hemorrhoids

2.4 药物-成分-靶点-通路网络图

对模块网络中的度值、紧密度和介数3 个参数进行筛选得到8 个核心基因,分别为蛋白激酶B(Akt)1、肿瘤蛋白p53(TP53)、白细胞介素6(IL-6)、表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、雌激素受体1(ESR1)、缺氧诱导因子1A(HIF1A)和肿瘤坏死因子(TNF)。对其进行分析,选择其中的部分通路进行了可视化,见图7;将分析结果导入Cytoscape 软件绘制药物-成分-靶点-通路网络图,见图8。

图6 脉络舒通丸治疗痔疮PPI 网络GO 和KEGG 富集分析结果Fig 6 GO and KEGG enrichment analysis of PPI network of Mailuo Shutong pills in the treatment of hemorrhoids

图7 脉络舒通丸作用于MAPK 信号通路示意图Fig 7 Schematic diagram of MAPK signaling pathway acted by Mailuo Shutong pills

图8 药物-成分-靶点-通路网络图Fig 8 Drug-component-target-pathway network

2.5 分子对接

使用AutoDockTools 1.5.6 软件对8 个关键靶点及其相对应的化合物进行分子对接。选择部分对接结果进行可视化处理,见图9。一般来说,结合能越小,对接效果越好。

图9 分子对接Fig 9 Molecular docking

3 讨论

痔疮是肛管皮肤下静脉丛扩张、屈曲形成的柔软静脉团,其主要特征为肛门疼痛、有坠胀感、瘙痒和肛周湿疹等。该病是常见的肛肠类疾病,可发生于任意年龄。研究结果发现,痔疮在20～40 岁人群中较多见,且随着年龄的增长而加重[6]。部分患者由于患有痔疮,恐惧排便,久之导致便秘,反而加重原有痔疮的病情。余文美等[7]的研究结果发现,脉络舒通丸对于痔疮过程中的红肿热痛以及术后的创面恢复具有显著疗效,能有效抑制炎症反应。

本研究通过网络药理学与分子对接的方法预测了脉络舒通丸治疗痔疮的作用机制。通过数据库与文献检索得到脉络舒通丸中的215 个化合物与310 个靶点,通过关键靶点的筛选以及分子对接的验证发现了脉络舒通丸发挥作用可能的关键化学成分。如芒柄花素是黄芪和甘草中的化学成分,为异黄酮类化合物,具有抗炎、抗氧化、提高免疫功能、抗肿瘤及雌激素样作用等功效[8]。张彦平等[9]通过动物实验发现,芒柄花素可以提升小鼠胸腺及脾脏的T 淋巴细胞和B 淋巴细胞数量,促进小鼠免疫相关细胞因子、淋巴细胞增殖,进一步提高机体细胞免疫和体液免疫的功能。槲皮素是黄芪、黄柏、金银花和甘草的共有化学成分,为黄酮类化合物,具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤及调节免疫等功效[10]。司丽君等[11]的研究结果发现,槲皮素具有良好的抗炎活性,能减少炎症细胞活性氧和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的释放,可以选择性抑制环氧合酶2(COX-2),还能促进小鼠脾淋巴细胞的增殖。任改艳等[12]通过实验证实了槲皮素对脂多糖诱导小鼠RAW264.7 细胞炎症具有抑制作用,具体的机制可能是槲皮素参与调控Toll 样受体4/核因子κB(NF-κB)通路,从而抑制COX-2 和细胞炎症因子IL-6、TNF-α 及白细胞介素1β 的表达。木犀草素是金银花的活性成分,为黄酮类化合物,具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化和抗病毒等多种功效[13]。研究结果表明,木犀草素具有显著的抗炎作用,主要通过降低多种促炎细胞因子(如TNF-α、IL-6 和白细胞介素8 等)、趋化因子(如MCP-1)的表达而发挥作用[14]。木犀草素的抗炎活性还与其调控促炎基因相关。NF-κB 是促炎基因表达调节的因子之一,正常情况下NF-κB 与其抑制蛋白互相结合存在于细胞质中不表达活性,一旦受到刺激,抑制蛋白被降解,NF-κB 被释放,从而诱导多种靶基因转录,加剧炎症反应[15-16]。Kim 等[17]的研究结果发现,木犀草素可以通过干扰P300 与TNF-α 启动子区间结合,减少乙酰化酶(HAT)与NF-κB 和TNF-α 乙酰化的相互作用,进而抑制NF-κB 下游促炎因子转录,减轻炎症反应。汉黄芩素是苍术的活性成分,为黄酮类化合物,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗病毒和神经保护等功效。有研究结果表明,汉黄芩素能抑制脂多糖诱导的炎症介质一氧化氮和前列腺素E2 的产生,同时对COX-2 有直接的抑制作用[18]。Tang 等[19]发现,汉黄芩素能够提高自然杀伤细胞的杀伤作用和巨噬细胞的吞噬作用,剂量依赖性地增加细胞因子白细胞介素1α、TNF-α 的转录水平,抑制NF-κB 的下游表达,表明汉黄芩素有良好的抗炎活性。

对成分-靶点网络和PPI 网络进行分析,同时查阅相关文献,最终发现Akt1、TP53、IL-6、EGFR、VEGFA、ESR1、HIF1A 和TNF 可能是药物发挥作用的关键靶点。脉络舒通丸可能通过抑制炎症反应、提高免疫和促进细胞增殖等多个分子机制来发挥治疗痔疮的作用。在痔疮的发生发展以及愈合的过程中会引发一系列的炎症反应[20]。IL-6、TNF-α 是重要的促炎因子,在炎症反应中发挥了重要作用[21-23]。IL-6、TNF-α 等炎症因子所诱导的免疫机制在抗菌抗感染的同时,也会不可避免的对感染部位造成一定的炎症病理性损害[24-25]。林巧娟等[26]对大鼠痔疮术后的创面愈合阶段中血清炎症因子的表达量进行了研究,发现使用肛愈散治疗后IL-6、TNF-α 等炎症因子的表达量均显著降低。分子对接结果表明,脉络舒通丸中槲皮素、木犀草素等化合物与IL-6、TNF-α 有较强的结合能力,并且能抑制TNF-α、IL-6 的产生[27]。EGFR 是广泛分布于人体各组织细胞膜上的糖蛋白,具有酪氨酸激酶的活性,EGFR 及其配体是细胞信号传导系统的一部分,研究结果表明,EGFR 的信号传导关乎细胞的凋亡、增殖、分化、迁移和细胞周期循环[28]。有研究结果发现,EGFR 可以加速创面细胞分裂,促进细胞增殖,改变细胞的趋化性,增加细胞的迁移从而加速创面愈合[29]。VEGFA 是作用较强的一种促血管生长因子,是新生血管形成中心调控因子的有丝分裂原,其表达对血管内皮细胞的异常增殖具有重要作用[30]。胡春华等[31]通过对临床患者组织微血管的观测,认为VEGFA 参与了痔疮的形成过程,抑制VEGFA的表达有利于痔疮的恢复。槲皮素是脉络舒通丸的一种有效成分,分子对接结果显示,其与VEGFR 和EGFR 有较强的结合能力。王晓庆等[32]通过血管增生模型观测槲皮素对于血管生成的影响,发现槲皮素能抑制VEGF 和碱性成纤维生长因子所诱导的血管生成,同时对内皮细胞增殖具有抑制作用[33]。脉络舒通丸可能是通过调节上述靶点来发挥治疗痔疮的作用。

GO 与KEGG 富集分析结果显示,脉络舒通丸有效成分调控的靶点集中在多种BP、CC 和MF 上,如细胞对化学刺激的反应、多细胞生物过程的调控、细胞对有机物质的反应、对外部刺激的反应、对含氧化合物的响应、细胞增殖及对分子功能的正向调节等。脉络舒通丸治疗痔疮可能是作用于PI3K-Akt 信号通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药性、MAPK 信号通路、癌症通路、癌症中的蛋白多糖、人类巨细胞病毒感染、人乳头瘤病毒感染、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染及乳腺癌等信号通路。这些通路与痔疮的发生发展关系密切。MAPK 信号通路主要调控炎症相关基因的表达、细胞能量代谢、细胞增殖和凋亡等,该通路的激活途径相对保守[34-35]。

综上所述,脉络舒通丸可以通过调控炎症反应来治疗痔疮以及痔疮术后创面的愈合。本研究采用网络药理学方法,探索了脉络舒通丸治疗痔疮的作用机制并通过分子对接验证。在系统层面揭示了脉络舒通丸可能是通过抑制炎症反应、提高免疫、促进细胞增殖等多个分子机制来发挥治疗痔疮的作用。然而,本研究主要基于数据分析开展研究,因此需要进一步的体内、体外实验来验证研究结果。