菊花含量测定方法提高

王小芳 郑倩倩 路丽娟

石家庄市食品药品检验中心，河北 石家庄 050011

菊花为菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥头状花序。具有散风清热、平肝明目、清热解毒的功效，用于风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花、疮痈肿毒[1]。药理研究[2-3]表明菊花具有抗病毒、抑菌、抗炎、抗氧化等药理作用，其主要成分为黄酮类、有机酸类、挥发油类等。

该品种现行标准为2020版《中国药典》，含量测定以绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸3个成分作为其质控成分，采用高效液相色谱法，以乙腈-0.1%磷酸溶液进行梯度洗脱。但在日常检验中发现，采用药典方法测定含量时3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸与其同分异构体1,5-O-二咖啡酰基奎宁酸不能有效分离，导致计算结果偏差较大，不能真实反应该成分含量，需要对现有方法进行改进。虽然近年来关于菊花多成分测定的报道较多[4-11]，但并未检索到能将二者有效分离的高效液相色谱方法。因此本实验对菊花含量测定方法进行改进，通过改变流动相对色谱条件进行改进和优化，实现对3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的有效分离，从而提高检测结果的准确性。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters ARC高效液相色谱仪(美国Waters公司)；CPA225D电子天平(德国赛多利斯公司)；Elmasonic P 超声波清洗仪(德国Elma公司)；水浴锅(天津泰斯特)。

1.2 试药 绿原酸对照品(批号：110753-201716，纯度以99.3%计)、木犀草苷对照品(批号：111720-201408，纯度以94.8%计)、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品(批号：111782-201706，纯度以97.3%计)均购自中国食品药品检定研究院；1,5-O-二咖啡酰基奎宁酸(批号：E-0447-18042523，上海同田生物技术股份有限公司)。乙腈、甲醇、冰醋酸、磷酸均为色谱纯；水为超纯水。4批菊花(购自市场)经本中心毕飞霞老师鉴定为菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥头状花序，样品1为杭白菊、样品2～4为贡菊。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性 试验Inertsil ODS-3 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-甲醇-0.2%冰醋酸溶液梯度洗脱，程序见表1，检测波长为348 nm，柱温30 ℃，流速1 mL/min，进样量10 μL。

表1 梯度洗脱表

本方法，绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸各峰的理论板数均大于10000，分离度均大于1.5。本方法和药典方法条件下，对照品和供试品色谱图如图1所示。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品储备液和混合对照品溶液的制备 分别精密称取绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品适量，加70%甲醇分别制成含绿原酸1.5729 mg/mL、木犀草苷1.5744 mg/mL、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸1.9499 mg/mL的对照品储备液。分别精密吸取上述储备液各1 mL，用70%甲醇定容至25 mL，即得混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取菊花粉末(过一号筛)约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率300 W，频率45 kHz)40 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学评价

2.3.1 线性关系考察 分别精密吸取2.2.1项下的各对照品储备液1 mL置5、10、25、50 mL量瓶、2 mL置250 mL量瓶，加70%甲醇定容至刻度，摇匀，即得稀释5、10、25、50、125倍的5 个浓度梯度的线性考察混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积。以对照品浓度为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系

2.3.2 精密度考察 取2.3.3项下制备的样品溶液1份，按照2.1项下色谱条件进行测定，连续进样6次，记录色谱图峰面积，测得绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸峰面积的RSD值分别为0.85%、0.44%、0.52%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性考察 取同一批供试品，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”色谱条件下进样测定，测得6份样品中绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量的RSD值分别为0.64%、1.41%、1.03%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 回收率试验 精密称取同一批供试品约0.125 g，共6份，置于具塞锥形瓶中，精密加入各对照品，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”色谱条件下进样测定，计算回收率。结果见表3，结果说明该方法的准确度良好。

表3 加样回收率试验结果 (n=6)

2.3.5 稳定性考察 取2.3.3项下制备的样品溶液1份，按照2.1项下色谱条件进行测定，分别在0、2、6、8、16、24 h进样，记录色谱图，计算3种成分峰面积的RSD值，绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量的RSD值分别为1.25%、0.66%、0.55%，表明该方法稳定性良好。

2.3.6 色谱柱耐用性试验 取同一批样品，照“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，对不同品牌色谱柱的耐用性进行考察，并计算含量。其中Agilent 5Tc-C18(2)(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱在2.1色谱条件下木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的分离度均小于1.5。TechMate C18-ST(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm，5 μm)系统适用性较好，结果见表4。

表4 不同品牌色谱柱耐用性结果

2.3.7 样品的测定 按2.2.2项下方法，制备4批菊花供试品溶液，按2.1项下色谱条件和药典方法分别进行含量测定，记录峰面积，按干燥品计算样品中绿原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量。结果见表5。

表5 样品测定结果(%)对比表 (n=3)

3 讨论

3.1 分析条件的优化 实验过程中首先选用了3种不同品牌色谱柱Agilent 5Tc-C18(2)(4.6 mm×250 mm，5 μm)、TechMate C18-ST(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm，5 μm)，在药典方法乙腈-0.1%磷酸溶液的基础上调整流动相比例，但3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸和1,5-O-二咖啡酰基奎宁酸均重合在一起，无法分离。之后改变流动相组成，采用甲醇-磷酸溶液[2]系统，可使3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸和1,5-O-二咖啡酰基奎宁酸分离度大于1.5，但木犀草苷分离度小于1.5。后又试验了乙腈-甲醇-0.1%磷酸系统和乙腈-甲醇-0.2%冰醋酸[4-5]系统，发现，乙腈-甲醇-0.2%冰醋酸梯度洗脱各成分分离度较好，绿原酸、木犀草苷，3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸分离度均大于1.5，最终选择该系统梯度洗脱。

3.2 检测波长的选择 通过扫描200～400 nm波长范围内的紫外吸收，发现绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的最大吸收分别为326.1、348.8、327.3 nm，绿原酸和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸在327 nm与348 nm处的峰面积比接近1.8，木犀草苷在327 nm与348 nm处的峰面积比接近0.8，如果检测波长选择327 nm对3种成分峰面积影响较小，但是由于木犀草苷的含量较低，峰面积较小，对其准确度影响较大，因此本方法还是采用药典方法的348 nm。

3.3 2020版《中国药典》菊花含量测定 方法中3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸与1,5-O-二咖啡酰基奎宁酸不仅出峰时间一致，且二者混合物的紫外吸收与3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸也完全一致(如图2所示)，在日常检验中很容易误判，造成检验结果的误差。药典菊花中3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的限度为不得少于0.70%，由样品测定结果可以看出，3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量前后相差较大，有的甚至会影响其是否合格的判定。相比药典方法，本方法解决了3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的分离问题，检测结果更加可靠。

本实验采用的新方法能较好的分离菊花中的绿原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸，具有较高的灵敏度和准确度，重现性好，解决了现行方法3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸与1,5-O-二咖啡酰基奎宁酸不能分离的问题，可作为该品种含量方法改进的参考。