太子参复方对脾虚自汗大鼠的止汗作用及其机制研究

周春权 赵 立 蒋 畅 胡 娟，2*

1.福建省中医药科学院，福建 福州 350003;2.福建中医药大学，福建 福州 350122

中医认为，汗是人体内的津液受到阳气的蒸腾气化作用而从汗孔排出来的水液。在炎热的天气、室内温度过高、衣褥过厚或者精神紧张等情况下常常出现生理性多汗。如果出汗的部位、出汗量的多少、以及汗液的颜色和汗液的气味发生改变，可以通过这些来判断身体可能患的一些疾病。汗液生成与排泄的异常将导致多种汗证[1-2]。自汗是由于人体阴阳失衡，腠理不固，而引起人体津液外泄失常所产生的病证。

太子参复方[3]以福建道地药材太子参、蓝花参为原料。太子参具有益气补脾和生津润肺的功效；蓝花参具有补虚健脾，补虚损，止自汗、盗汗，除虚热，止咳化痰等功效。在中医药传统理论的指导下，合理组方；二者配伍共奏益气养阴、补虚健脾，具有治疗脾虚自汗之功效。本文通过建立脾虚自汗大鼠模型，观察太子参复方对脾虚自汗大鼠的止汗作用以及探讨其止汗的机制。

1 仪器与材料

1.1 实验动物 SD大鼠，SPF级，雌雄各半,体质量(180±20)g，上海伊莱克斯实验动物中心，许可证编号：Scxk(泸)2017-0005。

1.2 实验材料 和田-高垣氏试剂A、B(A液：碘浓度为2%无水乙醇溶液；B液：称取可溶性淀粉50 g，加入100 mL花生油中混匀)，硝酸毛果芸香碱(国药准字 H42021102，批号：13110401，武汉五景药业有限公司)；利血平注射液(国药准字 H12020905，批号：1210111，天津金耀氨基酸有限公司)； AchR抗体(Cell Signaling)、β-Actin抗体(Cell Signaling)、二抗(SAB))均购自CWbio.Co.Ltd公司。

1.3 仪器 电子天平(德国Sartorius)，脱色摇床(海门其林贝尔)，电泳仪(北京六一仪器厂)，垂直电泳槽、转印模块(美国Bio-Rad),高速离心机(Thermo)，NanoDrop 2000型分光光度计(Therno scientific)，7500荧光定量PCR仪(ABI)。

1.4 药物 太子参复方，本实验室自制，按专利[3]进行制备。全脑组织：实验结束后，大鼠处死，在冰面上迅速取出全脑，分装于EP管内，-80 ℃保存，备用。

2 方法

2.1 止汗作用实验

2.1.1 脾虚自汗大鼠模型的建立[4]采用利血平所致脾虚大鼠的方法建立模型，动物房适应性喂养1周，按体重随机分成5组，即：正常对照组，模型对照组，太子参复方高、中、低组。除正常对照组外，其余各组每天上午，以利血平0.5 mg·kg-1腹腔注射，连续14 d，制备脾虚型大鼠，并观察动物行为。

2.1.2 给药与实验 给药组于造模的第8天开始，每天下午灌胃给药，正常对照组和利血平组给等体积的蒸馏水，太子参复方高、中、低组(2.4、1.2、0.6 g·kg-1)，分别按成人临床推荐剂量的5倍、10倍、20倍灌胃，连续给药14 d。分别在开始给药的第1、7、14天，末次给药后45 min皮下注射毛果芸香碱液35 mg·kg-1(正常组注射生理盐水)，15 min将动物转入固定器内，右后足固定笼外，适应15 min，用棉签蘸上无水乙醇轻轻将足跖部污物擦拭干净，于大鼠足跖部皮肤涂上和田-高恒氏试剂A液，待干燥后，再薄薄涂上B液，然后于15 min后用10倍放大镜计数深紫色着色点(即汗点)的数目。

2.2 Western Blot法检测乙酰胆碱受体的表达量实验 将脑组织剪切成小块，称重，按每20 mg组织加400 μL的比例加入裂解液，提取总蛋白，用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量，取相同质量蛋白变性上样，SDS-PAGE 凝胶电泳、转膜。封闭液封闭 2 h后置于一抗稀释液[AchR(1∶300)，β-actin(1∶1 000)]4 ℃过夜。次日洗膜，加入二抗稀释液[SAB(1∶3000)]孵育 1 h，用化学发光法于暗室中曝光、显影、定影。凝胶成像仪摄像后用image J软件分析灰度值。

2.3 RT-PCR法检测乙酰胆碱受体mRNA的表达实验

2.3.1 引物设计 本实验采用的AchR基因及内参基因的引物序列。见表1。

表1 引物序列表

2.3.2 实验步骤 将脑组织剪切成小块，称重，用超纯RNA提取试剂盒提取组织样本中总RNA；取RNA进行电泳，检测RNA的完整性；用DNase Ⅰ试剂盒对RNA中残留的基因组DNA进行消化处理；用HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒进行反转录。

2.3.3 Real-Time PCR进行分析 用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△ct法进行数据的相对定量分析。

3 结果

3.1 太子参复方对脾虚自汗大鼠模型的影响 由表2可知，正常对照组与模型组比较，均有显著性差异；而给药组的高、中剂量组在第7天和第14天，止汗效果明显，与模型组比较具有显著性差异，低剂量组则差异不显著。

表2 太子参复方对脾虚自汗大鼠模型的影响

3.2 太子参复方对脾虚大鼠体重的影响 由表3可知，实验前各组大鼠体重差异无显著性，造模后，模型组及3个太子参复方剂量组大鼠体重增长幅度较正常对照组下降(P<0.05)。实验后, 3个太子参复方剂量组大鼠的体重略高于模型组，说明本方具有一定健脾效果，但其与模型组之间的差异无显著性，可能服药时间较短，随着实验时间延长，健脾效果更显著，对大鼠体重影响更大。

表3 太子参复方对脾虚大鼠体重的影响

3.3 太子参复方对脾虚自汗模型大鼠的AchR蛋白含量影响 经过Western Blot 分析曝光及洗片后结果如图1所示。

计算乙酰胆碱受体的相对灰度值，采用公式：乙酰胆碱受体的相对灰度值=乙酰胆碱受体灰度值/肌动蛋白灰度值，计算结果见表4。

表4 太子参复方中对脾虚自汗模型大鼠AChR蛋白表达灰度值的影响

以上实验结果显示，与正常对照组比较，模型组大鼠脑组织AchR蛋白的表达明显增加，不同剂量太子参复方能不同程度降低模型大鼠脑组织中AchR蛋白的表达，与模型组比较，太子参复方高、中剂量组AchR蛋白的表达明显下降(P<0.01)。

3.4 RNA完整性及纯度检测 琼脂糖凝胶电泳结果显示，28 s和18 s rRNA条带清晰明亮，表明RNA完整性良好，微量紫外分光光度计测定RNA的吸光度，其OD260/280值均在1.8～2.1之间，表明RNA纯度较高，无杂质污染(图2)。

3.5 Real-Time PCR检测结果 各样本目的基因和内参基因实时扩增曲线和溶解曲线图(图3、图4)显示引物特异性良好。

3.6 相对定量分析结果 按照2-△△ct相对定量法，计算各样品的目的基因相对定量结果，即各个样品对于对照样品，目的基因mRNA转录水平的差异，与正常对照组比较，模型组大鼠AchR mRNA表达显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，各给药组AchR mRNA表达显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。提示太子参复方能够下调脾虚自汗大鼠大脑中AchR mRNA，表达结果如表5所示。

表5 太子参复方对脾虚自汗模型大鼠AchR mRNA相对表达量的影响

4 讨论

利血平是属于外围交感神经抑制药或去甲肾上腺素能神经末梢阻断药，利血平能够抑制交感神经系统的功能，使得副交感神经系统的功能就相对占优，就会出现和中医脾虚证有高度相似的症状，如鼻粘膜血管扩张而鼻塞，消化功能亢进而致大便次数增多、胃酸分泌增加、溃疡病等。利血平可用于多种动物制成脾虚模型,其表现的症状与人类最常见脾虚证型很相似。这种造模方法简单易行,可靠性和重现性强。同时其发病机制有相当一部分与胆碱能神经功能亢进、植物神经功能紊乱有关。出汗是一种植物神经调控性活动，交感神经和副交感神经是调节人体内脏功能的神经装置，其功能为调节心肌、平滑肌和腺体(包括消化腺、汗腺、部分内分泌腺)的活动，一般汗腺由交感神经支配。交感和副交感神经节前纤维释放的递质是乙酰胆碱。故神经递质乙酰胆碱的变化可能是调控机体汗腺出汗量的机理之一。

实验结果表明大鼠在经过注射利血平之后，出现了明显的体重下降的情况，说明大鼠产生了脾虚的症状，脾虚后的大鼠在注射毛果芸香碱液之后，汗液的量有明显的增加，表明脾虚自汗模型大鼠的成功建立。本研究对太子参复方的止汗机制进行了初步探讨，实验中检测到正常的大鼠也有微量的AchR mRNA 表达，刺激脾虚自汗模型造模后，大脑内AchR表达显著增高，说明脾虚自汗能激活AchR信号通路的活化，但是否直接激活，还有哪些参与作用的相关蛋白，有待下一步继续研究。