电针“水沟”对脑梗死大鼠脑动脉血管平滑肌中Ca2﹢-ATP酶及钠钙交换体表达的影响

徐彦龙,徐秀梅,郭茂娟,姜希娟

(1.甘肃省中医院,兰州 730050;2.天津中医药大学,天津 300193)

针刺治疗脑梗死疗效肯定,已普遍应用于临床。近年来,国内外学者从多个角度阐述了针刺作用的机制,包括减轻患者的颅内炎症反应[1];保护血脑屏障、抑制脑细胞凋亡、减轻脑水肿,改善缺血再灌注损伤,改善脑血流,改善神经功能缺损[2-3];刺激脑皮质运动中枢,改善损伤部位血液循环,促进神经功能恢复,改善日常生活能力,降低致残率[4];促进神经元兴奋,促进新的神经传导通路的建立[5];增加脑血流,促进微血管内皮细胞增生,促进颅内血管新生,减少脑缺血损伤,保护脑组织[6]等。脑梗死应及时恢复血液循环,尽量减少缺血所致神经细胞变性程度及范围,尽管再灌注可能产生损伤,但再灌注利大于弊,改善脑循环是治疗脑梗死的关键环节之一[7]。研究表明动脉血管平滑肌细胞胞内Ca2﹢浓度升高是导致血管收缩的关键因素,虽然胞质内Ca2﹢浓度的调节机制十分复杂,但Ca2﹢浓度上升后的降低过程,主要由内质网、质膜上的Ca2﹢-ATP酶和钠钙交换体两种机制介导[8]。因此,本实验以脑动脉血管平滑肌中Ca2﹢-ATP酶及钠钙交换体中存在于脑动脉血管中的NCX1、NCX3两种亚基的表达为切入点,探讨电针“水沟”穴对脑梗死大鼠改善脑循环的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级健康雄性Wistar大鼠130只,体质量(200±20)g,许可证号为SCXK(京)2016-0006,购于北京维通利华实验动物技术有限公司。于安静环境下分笼饲养,室温21～27 ℃,相对湿度(50±5)%,自然光照,空气流通。适应性饲养1周后,在SPSS 23.0统计软件中生成随机数字表,通过查阅随机数字表随机分为空白组10只,模型组、电针组和假手术组各40只,后3组按术后3 h、6 h、12 h、24 h共4个时相分为4组,每个时相10只。实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科技部颁布的《关于善待实验动物的指导意见》[9]。

1.2 主要试剂与仪器

逆转录试剂盒(美国Fermentas公司,K1622),引物(上海生工公司),荧光定量试剂盒(美国Fermentas公司,T2210),DEPC(美国Amresco公司,E476-100 ML),抗Ca2﹢-ATP酶抗体(Abcam公司,ab2825),羊抗小鼠IgGH&L(HRP)抗体(Abcam公司,ab6789),硝酸纤维膜(美国Millpore公司,HATF00010),ECL发光试剂盒(美国Millpore公司,WBKLS0050),内参(Santa公司,sc-81178);LH202H型韩氏电针仪(北京华运安特科技公司);激光多谱勒血流仪(北京吉安得尔科技有限公司);Micro21R台式高速冷冻离心机(美国BECKMAN公司);DYY-11B型电泳仪(北京六一生物科技有限公司);ZDP-A2050A恒温孵育箱(上海智城分析仪器制造有限公司);GIS-2008数码凝胶图像分析处理系统(上海天能科技有限公司);7500FAST荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3 造模方法

参照LONGA E Z等[10]造模方法,建立大鼠MCAO模型。动物适应性喂养1周,术前12 h禁食,自由饮水。用10%的水合氯醛溶液(每100 g体质量注射0.3 mL)腹腔注射,将麻醉后的大鼠四肢用皮筋牵拉固定,仰卧位放置于手术板上,用烤灯将大鼠体温维持在(37.0±0.5)℃。在大鼠颈前均匀涂抹肥皂水后,用刀片轻轻刮剔颈前的鼠毛,碘伏消毒,沿颈部正中偏左侧切口,依次分离出左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉,然后结扎颈总动脉近心端、颈外动脉和分叉处放置动脉夹。在两动脉夹之间用1 mL注射器扎一个小孔,选择直径为0.204 mm的尼龙线栓插入小孔,插入尼龙线栓后放开颈总动脉分叉处动脉夹,接着继续插入线栓总计长度为18～22 mm,线栓进入颈内动脉至稍遇阻力即停止进线,结扎线栓。用0.9%的生理盐水冲洗手术切口,再用棉球擦拭干净切口后,注入适量庆大霉素,然后缝合皮肤。用碘伏擦拭缝合后的伤口,重复2次。假手术组依次分离出左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉,牵拉颈总动脉和颈内动脉后,缝合皮肤,并不插入线栓。

以大鼠颅骨冠状缝与矢状缝结合点为原点,冠状缝向后4 mm、矢状缝旁开3 mm的位置固定激光多谱勒探头,监测局部脑血流量。以大鼠麻醉5 min后局部脑血流量为基值,MCAO后即刻再次测定局部脑血流量,造模后局部脑血流量下降至基值血流量的25%～30%时视为造模成功[11]。若实验过程中大鼠死亡,或在取脑时见有蛛网膜下腔出血或颈内动脉分叉部出血则排除。

1.4 干预方法

电针组造模后即刻针刺大鼠“水沟”穴,定位参照华兴邦等主编的《大鼠穴位图谱的研制》[12],在大鼠鼻中隔下用0.25 mm×13 mm毫针方向向上斜刺2 mm,并在该部位下约2 mm处刺入另一毫针作为参考电极,“水沟”穴接正极,参考电极接负极,用15 Hz、2 mA的连续波刺激20 min[13]。空白组、假手术组和模型组均同样抓取固定,但不做任何治疗。电针组、模型组、假手术组动物均按时相断头处死,空白对照组动物在第1次抓取后6 h内断头处死。

1.5 样本制备

为了研究样本更加准确,本次实验采用分跟分离法[14]。大鼠断头后,迅速剥离大脑,用4 ℃生理盐水冲洗,置于冰袋上,在外科显微镜下分别分离和剪取梗死侧的大脑前动脉、中动脉和后动脉各8 mm(以各动脉从Willis环分出处为起点,沿各动脉循行8 mm处为终点)。然后将脑动脉血管迅速置于液氮中保存备用。

1.6 观察指标

1.6.1 脑梗死半球脑血流的监测[11]

各组经水合氯醛溶液麻醉后,仰卧位固定,手术常规操作,沿头皮正中纵向切口约 2 cm,分离皮下组织,剥离骨膜,暴露冠状缝及矢状缝(此手术操作模型组、电针组、假手术组同造模一起进行,空白组不进行),多普勒激光探头固定部位以冠状缝与矢状缝结合点为原点,冠状缝向后4 mm,矢状缝旁开3 mm,定位后用牙科钻将颅骨磨薄,固定激光多普勒探头,每只大鼠测定1 min,取1 min内平均血流值作为检测所需数值。依次记录大鼠麻醉后线栓要阻塞侧大脑局部脑血流量(将此时脑血流量定为基值100),造模后5 min线栓阻塞侧大脑局部脑血流量(regional cerebral blood flow, rCBF)和术后3 h、6 h、12 h、24 h阻塞侧局部脑血流量,并和基值对比,得出相应的脑血流数值。

1.6.2 Western blot法检测血管组织中Ca2﹢-ATP酶的相对表达量

从液氮中取出脑动脉血管,用RIPA裂解液抽提蛋白,采用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定后,各样品取20 µg,加等量样本处理液后,100 ℃煮沸5 min,进行10% SDS-PAGE变性电泳,经电转移方式转置硝酸纤维素膜上,用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭2 h,而后加入含一抗的封闭液(1:3000)4 ℃恒温室摇床孵育过夜,洗去抗体后加入含二抗的封闭液(1:2000),室温摇床作用2 h。洗去抗体后按ECL发光试剂盒说明依次进行化学显影。将胶片进行扫描或拍照,用凝胶图像处理系统分析目标条带和内参条带的净吸光度值,最终计算出目标条带与内参条带的比值。

1.6.3 RT-qPCR法检测血管中NCX1及NCX3的表达量

将大鼠处死后剥离脑动脉血管,加入1 mL裂解液充分裂解组织,按照RNA提取试剂盒说明书操作,提取总RNA。测量RNA的浓度和纯度。然后再进行一步法荧光定量RT-qPCR反应。条件为预变性95 ℃持续2 min;变性95 ℃持续15 s;扩增60 ℃持续60 s;退火72 ℃持续45 s,变性和延伸设置为40个循环扩增(约50 min)。通过CFX manager 3.1软件读取Ct值,计算平均值。mRNA相对表达量采用2﹣△△Ct法进行计算分析。引物序列见表1。

表1 各检测指标引物序列

1.7 统计学方法

采用SPSS 23.0软件对各组数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示,重复测量资料比较选用重复测量方差分析,根据球形检验结果采用Sphericity Assumed法分析组间差异,后选用Bonferroni法进行两两比较;多组数据比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法;方差不齐则采用Games-Howell法。若数据不符合正态分布,采用Cruskal Wallis秩和检验进行分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电针对MCAO模型大鼠脑血流量的影响

与假手术组比较,模型组和电针组各时项血流量均明显下降,差异具有统计学意义(P＜0.01)。电针干预后,电针组大鼠脑血流量均高于模型组,其中在3 h、6 h、12 h时差异具有统计学意义(P＜0.05)。详见表2。

表2 各时相大鼠相对脑血流量对比 (±s)

表2 各时相大鼠相对脑血流量对比 (±s)

注:与假手术组比较1)P＜0.01;与模型组比较2)P＜0.05

组别 n 3 h 6 h 12 h 24 h假手术组 10 105.619±7.681 105.620±7.679 105.621±7.681 105.620±7.679模型组 10 79.001±7.5601) 71.501±9.7901) 60.171±8.6601) 68.411±16.2211)电针组 10 88.549±6.9211)2) 83.531±5.3301)2) 72.001±8.6691)2) 72.910±6.9901)

2.2 电针对 MCAO模型大鼠脑动脉血管平滑肌中Ca2﹢-ATP酶表达的影响

与空白组和假手术组比较,模型组各时项Ca2﹢-ATP酶表达量的表达水平均有下调,但仅3 h时项下调差异具有统计学意义(P＜0.05);与同时项模型组比较,电针组3 h时项Ca2﹢-ATP酶表达量的表达水平上调,差异具有统计学意义(P＜0.05)。详见图1、表3。

表3 4组不同时项脑动脉血管平滑肌中Ca2﹢-ATP酶表达的比较 (±s)

表3 4组不同时项脑动脉血管平滑肌中Ca2﹢-ATP酶表达的比较 (±s)

注:与模型组比较1)P＜0.05

组别 n 3 h 6 h 12 h 24 h空白组 10 1.206±0.3021) - - -假手术组 10 1.323±0.1971) 1.234±0.086 1.556±0.539 1.355±0.205模型组 10 0.827±0.279 1.056±0.154 1.205±0.296 1.094±0.189电针组 10 1.174±0.1451) 1.185±0.126 1.218±0.324 1.119±0.199

图1 各组大鼠脑动脉血管平滑肌中Ca2﹢-ATP酶免疫印迹实验结果

2.3 电针对MCAO模型大鼠脑动脉血管平滑肌中NCX1和NCX3 mRNA表达的影响

2.3.1 电针对MCAO模型大鼠脑动脉血管平滑肌中NCX1 mRNA表达的影响

与空白组和假手术组比较,模型组各时项NCX1 mRNA的表达水平均下调,差异有统计学意义(P＜0.05);与同时项模型组比较,电针组3 h、6 h时项NCX1 mRNA的表达水平上调,差异有统计学意义(P＜0.05)。详见表4。

表4 4组不同时项脑动脉血管平滑肌中NCX1 mRNA表达的比较 (±s)

表4 4组不同时项脑动脉血管平滑肌中NCX1 mRNA表达的比较 (±s)

注:与模型组比较1)P＜0.05

组别 n 3 h 6 h 12 h 24 h空白组 10 1.056±0.0731) - - -假手术组 10 1.075±0.1011) 1.003±0.0911) 1.000±0.0341) 1.001±0.0491)模型组 10 0.744±0.232 0.775±0.045 0.768±0.211 0.923±0.017电针组 10 1.014±0.0851) 0.967±0.1761) 0.883±0.068 0.939±0.043

2.3.2 电针对MCAO模型大鼠脑动脉血管平滑肌中NCX3 mRNA表达的影响

与空白组和假手术组比较,模型组各时项NCX3 mRNA的表达水平均下调,差异有统计学意义(P＜0.05);与同时项模型组比较,电针组3 h时项,NCX3 mRNA含量的表达水平上调,差异有统计学意义(P＜0.05)。详见表5。

表5 4组不同时项脑动脉血管平滑肌中NCX3 mRNA表达量的比较 (±s)

表5 4组不同时项脑动脉血管平滑肌中NCX3 mRNA表达量的比较 (±s)

注:与模型组比较1)P＜0.05

组别 n 3 h 6 h 12 h 24 h空白组 10 1.011±0.0721) - - -假手术组 10 1.007±0.1381) 1.001±0.0561) 1.013±0.1921) 1.036±0.0471)模型组 10 0.719±0.163 0.832±0.135 0.615±0.072 0.660±0.267电针组 10 0.950±0.0381) 0.973±0.088 0.999±0.369 0.792±0.108

3 讨论

3.1 水沟的选穴依据及“脑表面动脉血管枢纽学说”

水沟是石学敏院士创立的醒脑开窍针刺法治疗中风的主穴之一,治疗脑梗死的疗效已经被临床所证实,并被国家科技部和中医药管理局确立为中医药科技成果在全国进行推广。前期研究证实针刺MCAO大鼠“水沟”穴可缓解大脑中动脉平滑肌痉挛[15],促进缺血半暗带的血管舒张[16],并能促进血管新生及侧支循环的建立[17]。通过系列研究,导师杜元灏教授初步提出了脑梗死侧支循环发生发展的“脑表面动脉血管枢纽学说”,即当脑梗死急性发生后,脑表面侧支血管系统犹如一个“闸门”,决定着脑缺血区能否及时有效地接受来自非缺血区的侧支循环血流,并压送这些代偿血流进入微细血管,以营养缺血的神经元组织,“闸门”的机能状态决定着缺血细胞的命运。急性脑梗死发生后,造成“闸门”的阻力增大,血管自律运动出现高频率低振幅,其流质、流场的动态耦合发生障碍,表现为“高速低效震荡”,成为缺血脑组织获取正常血流的障碍[18]。研究还发现针刺并非如扩张血管的药物那样,只是简单的扩张血管,而是有效地改善微血管的舒缩协调运动,协调流质、流场的动态耦合运动。因此,针刺水沟改善脑血管的机能状态,促进脑表面血管侧支循环是治疗急性脑血管病的重要途径,于是脑表面血管系统就成为研究电针水沟治疗脑血管病效应的切入点之一。

3.2 急性脑血管病选水沟穴的理论基础

《素问·阴阳应象大论》:“阴阳者,天地之道也,万物之纲纪,变化之父母,生杀之本始,神明之府也,治病必求于本。”据此中医学将“调和阴阳”作为治疗疾病的大法和总纲。任脉总任一身之阴经,调节阴经气血,为“阴脉之海”,督脉总督一身之阳经,为“阳脉之海”,从循行线路上来看[19]任脉循行“上行环绕口唇,经面部进入目眶下,联系与目”、督脉循行“沿前额下行鼻柱,止于上唇系带处”。因此,水沟是任督二脉经脉循行线有穴通路上在头面部唯一的交会穴。因此要调和全身经脉的阴阳,非水沟莫属;而这也是“急救刺水沟”的真正理论依据。石学敏院士在治疗脑梗死患者昏迷的时候,采用雀啄手法急刺水沟穴时,要求刺激量必须达到使患者流泪、流涕或者额头汗出为止,其实这也是阴阳交感、阴阳调和后的具体临床表现[20]。故在动物实验中,笔者用电针刺激“水沟”,既能保证针刺效应的一致性,也能体现临床醒脑开窍针法的精髓。

3.3 血管平滑肌的舒缩与Ca2﹢浓度之间的关系

血管平滑肌细胞内Ca2﹢浓度的稳态对于血管平滑肌细胞的舒缩有重要的调节作用。研究表明血管平滑肌细胞内Ca2﹢浓度升高是导致血管收缩的关键因素,而细胞内Ca2﹢浓度升高主要通过细胞膜电压依赖性钙通道[21-22]和受体门控钙通道[23-24]使细胞外Ca2﹢大量内流,内流的Ca2﹢与钙调蛋白结合形成复合物激活肌球蛋白轻链激酶,从而进一步引发平滑肌的收缩。而细胞内Ca2﹢的清除,则主要通过两种机制,Na﹢-Ca2﹢交换[25]是Na﹢从膜的一侧转运到另一侧以交换Ca2﹢的反方向运动,它依赖于Na﹢-K﹢ATP酶建立的胞内外浓度以及膜电位;Ca2﹢-ATP酶通过主动的耗能,每分解一个ATP,可转运1～2个Ca2﹢到细胞外或肌浆网,同时,按1:2的比例转运H﹢到胞内,以维持膜内外的电中性。二者相互协作,可直接降低细胞内Ca2﹢浓度,磷酸化丝氨酸使平滑肌舒张。

3.4 实验结果对临床的指导意义

从本次实验结果发现大鼠脑梗死后24 h内,电针干预可明显抑制脑动脉血管平滑肌上 Ca2﹢-ATP酶和NCX mRNA表达的下调,虽其干预最佳时项二者不太一致,纠其原因可能是Ca2﹢-ATP酶对Ca2﹢的亲和性很高,在细胞排钙的过程中,主要起到一种灵敏的调节作用,而NCX对Ca2﹢的亲和性低,但转运容量高,能够清除胞内大量的Ca2﹢的缘故[26],而NCX1和NCX3对Ca2﹢的亲和性之间的差异,可能是造成电针干预时项NCX1和NCX3不完全一致的主要原因。结合笔者团队前期研究成果[27-28],提示笔者在脑梗死急性期针刺治疗或许可以以6 h左右为间隔,反复针刺,对提高临床疗效或许有积极意义。

综上所述,电针干预可明显抑制脑血管平滑肌上NCX1和NCX3及Ca2﹢-ATP酶表达量的下调,从而减轻脑动脉血管平滑肌内Ca2﹢超载,维持细胞内外Ca2﹢稳态,进而对于抑制缺血后血管平滑肌痉挛,保持血管功能和状态的正常,增加脑梗死区周围血流灌注具有重要作用,但针刺效应具有一定时效性。