健脾补肾方调控激素性股骨头坏死大鼠促成骨分化因子的研究

于 潼，谢利民，张振南，李玉彬，白 杨

(中国中医科学院广安门医院，北京 100053)

随着糖皮质激素的大量应用，激素性股骨头坏死的发生率逐年增加[1]。糖皮质激素可能通过多种途径促进成骨细胞凋亡、增加破骨细胞活性及促进骨髓间充质干细胞脂肪化从而引发股骨头坏死，但目前关于激素性股骨头坏死的机制尚无确切定论。近年来关于激素性股骨头坏死机制性研究多是围绕骨髓基质干细胞(BMSCs)开展的[2]，研究发现激素可诱导BMSCs成骨能力减弱、成脂肪分化能力增强[3-4]，即抑制骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化而转向促脂肪细胞分化。但激素影响BMSCs活性的途径尚不清楚。笔者团队前期研究发现以健脾利湿、补肾生髓、活血通络为法结合临床组方的健脾补肾方可有效缓解股骨头坏死患者临床症状，改善髋关节功能[5-6]；动物实验证实该方可诱导骨髓间质干细胞向成骨细胞分化，促进胶原纤维钙盐沉积，从而修复骨组织而扭转骨坏死[7]。而干细胞分化方向与细胞因子的调控作用密切相关[8-11]，据此推测健脾补肾方可能通过调控细胞因子而诱导促进激素性股骨头坏死BMSCs定向成骨分化。故本研究拟选择与成骨细胞分化相关的细胞因子，观察健脾补肾方对上述细胞因子的影响，从而筛选与健脾补肾方调控股骨头坏死BMSCs定向成骨细胞分化的相关细胞因子，并为深入探索健脾补肾方治疗激素性股骨头坏死的机制研究提供前期基础。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 健康成年雄性Wistar大鼠12只，体重约200 g，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，合格证编号：SCXK( 京 )2019-0010。每笼2只，标准饲料、自由饮水摄食喂养，室温控制在21～24 ℃，湿度维持在40%～70%，光照昼夜交替12 h。

1.2药品与试剂 健脾补肾方由茯苓、杜仲、菟丝子、炒白术、炙甘草、川牛膝、醋延胡索、红花等药物组成，由中国中医科学院广安门医院免煎药房提供。注射用甲泼尼龙琥珀酸钠, 瑞士辉瑞公司，批号:X60837；注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司，批号:D0709203；大肠杆菌内毒素L2880，美国Sigma公司，批号：039M4004V。

1.3主要仪器与设备 精密移液器(Eppendorf)，低温冷冻离心机(Heal Force，Neofuge 13R)，酶标仪(Biotek，Synergy H4)，摇床(苏坤，SKY-200B)，漩涡仪(天力，TL96-A),Fresco低温冷冻离心机(Thermo),MultiSkan3酶标仪(Thermo),Mini P-4电泳槽(Cavoy),湿转电泳槽(Cavoy),电泳仪(Bio-Rad)。

1.4实验方法 大鼠适应性饲养1周后，按照随机数字表法分为空白组、模型组、健脾补肾方组, 每组4只 。模型组及健脾补肾方组参考文献[12-13]建立激素性股骨头坏死模型：大肠杆菌内毒素20 μg/kg 腹腔注射2次，每次间隔24 h；末次注射内毒素24 h后，给予甲泼尼龙琥珀酸钠40 mg/kg 臀肌注射3次，每次间隔24 h，注射激素后给予腹腔注射青霉素钠4×104IU预防感染，1次/d。空白组仅注射等量生理盐水。造模结束后，健脾补肾方组每天灌胃2 g/mL健脾补肾汤[根据人与动物体表面积换算公式D鼠=D人×R鼠/R人(D为给药剂量，R为动物与人体表面积比值系数)及前期实验经验计算给药量[7，14]],灌胃量为10 mL/kg，模型组和空白组每天灌胃等量生理盐水，3组均连续灌胃12周。实验过程中观察各组大鼠运动、饮食等一般情况。

1.5样本采集 灌胃12周后，使用10 mL注射器抽取腹主动脉血液，4 ℃ 3 500 r/min离心(离心半径8.5 cm)15 min，分离出血清备用。处死各组大鼠，取股骨头，用骨钳将股骨头内组织夹碎，将夹碎的组织置于研钵中，加入液氮研磨至粉末状，加入9倍无菌生理盐水转移至1.5 mL EP管中，4 ℃ 3 000 r/min离心(离心半径8.5 cm)15 min，吸取上清液加入到新的1.5 mL EP管中备用。

1.6检测指标及方法 应用双抗体一步夹心法试剂盒酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot法分别检测各组大鼠血清及股骨头组织中骨形态发生蛋白2(BMP-2)、转化生长因子-β(TGF-β)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍性生长因子(PDGF)、成骨特异性细胞转录因子2(Runx2)表达情况。 ELISA检测按照说明书操作。Western blot检测：根据目的蛋白的分子量，配制12%分离胶，浓缩胶浓度为5%，将检测蛋白样品上样，20 μg/孔，电泳条件：浓缩胶恒压90 V，约20 min；分离胶恒压160 V，通过marker来确定电泳停止时间。转膜：300 mA恒流，0.45 μm孔径NC膜，转膜1 h，染色，观察转膜效果，封闭。一抗孵育：用3%BSA-TBST稀释一抗，室温孵育10 min，4 ℃过夜，第2天取出膜，室温孵育30 min。洗膜：TBST洗膜5次，每次3 min。二抗孵育：用5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG(H+L) HRP 或山羊抗小鼠IgG(H+L) HRP，1∶10 000，室温轻摇 40 min。洗膜：TBST洗膜6次，每次3 min。ECL加到膜上后反应3～5 min，胶片曝光10 s～5 min(曝光时间随不同光强度而调整)，显影2 min，定影。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况 在灌胃干预的前2周，模型组与健脾补肾方组大鼠少动,步态轻微跛行，进食减少，精神萎靡，毛发干枯；2周后，健脾补肾方组大鼠活动增多，进食恢复，精神逐步好转，毛发逐渐恢复正常光泽。空白组动物正常饮食饮水。

2.2各组大鼠ELISA检测血清及骨组织中相关细胞因子水平 健脾补肾方组血清BMP-2、TGF-β、VEGF水平及骨组织中BMP-2水平均明显高于空白组和模型组(P均<0.05)，空白组均明显高于模型组(P均<0.05)；其余指标各组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1及表2。

表1 空白组和激素性股骨头坏死各组大鼠ELISA检测血清相关细胞因子水平比较

表2 空白组和激素性股骨头坏死各组大鼠ELISA检测骨组织中相关细胞因子水平比较

2.3各组大鼠Western blot检测血清及骨组织中相关细胞因子表达情况 条带图显示，健脾补肾方组血清BMP-2表达量高于空白组和模型组，血清TGF-β表达量高于模型组，其余指标未见明显不同。见图1及图2。

图1 空白组和激素性股骨头坏死各组大鼠Western blot检测血清相关细胞因子表达情况

图2 空白组和激素性股骨头坏死各组大鼠Western blot检测骨组织中相关细胞因子表达情况

3 讨 论

《脾胃论·脾胃胜衰论》云：“脾病则下流乘肾，土克水则骨乏无力，是为骨蚀，令人骨髓空虚，足不能履地。”脾阳不足则运化传输不利，水津敷布失常，聚而生痰化湿；水湿之邪下聚于肾，则致肾之开阖不利，温煦失职，血失去温煦，遇寒则凝，聚而成瘀，形成痰瘀阻络的病理产物。健脾补肾方中茯苓甘平，善入脾经，益脾和胃、利水渗湿化痰；白术甘温，归脾胃经，健脾益胃、和中燥湿利水，现代药理研究证实白术具有增强免疫、促进骨生长、抗血小板聚集等功能[15-16]，其与茯苓合用可健脾益气、化痰渗湿，脾胃健运则痰湿得以化无以生，气血生化有源，精髓充满。杜仲甘温，归肝肾经，补肝肾、强筋骨；菟丝子平微辛，归肝脾肾经，补肾益精、善补肾阳，为平补阴阳之品，与杜仲合用可以温补肾阳、益精填髓、强筋健骨。胡晓梅等[17]研究发现，局部运用菟丝子总多糖可能通过促进Ⅱ型胶原的表达而修复家兔关节软骨缺损。杜仲及其提取物可促进成骨细胞的增殖与分化成熟以促进骨形成和愈合，同时还可间接抑制破骨细胞的分化和成熟，从而抑制骨吸收，以提高骨质量和骨强度[18-21]。牛膝甘苦酸平，入肝肾经，功善散瘀血、补肝肾、强筋骨，既入血分，又入气分，引药下行；延胡索辛苦温，功善活血、散瘀、理气、止痛；红花辛温，为活血通经、祛瘀止痛之要药；三药共用以活血祛瘀、行气止痛，气为血帅，血为气母，气行则推动血行，血行则不聚不瘀。甘草甘平，和中缓急，调和诸药。方聚补虚化痰祛瘀为一体，诸药兼施，攻守有度，共奏健脾利湿、补肾生髓、活血通络之功。健脾化痰湿，断痰湿生化传变之路，痰湿不聚则瘀滞不生；补肾生髓则肾充精足，骨骼筋骨得以濡养；同时辅以通络祛瘀之品，瘀祛新生而开气血周转运行之道，则气血生化有源，精髓得以充养，骨骼筋脉健运有力。骨髓间充质干细胞来源于中胚层的未分化间充质干细胞[22-23]，具有多向分化潜能，可分化成脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等多种细胞，而各种细胞因子和生长因子对其分化方向有着重要影响[8-11，24]。前期观察健脾补肾方对家兔激素性股骨头坏死模型的影响发现，健脾补肾方可有效促进骨组织修复，遏制骨髓间质干细胞向脂肪细胞分化的趋势而转向向成骨细胞分化，且成骨细胞分泌的胶原纤维上钙盐逐渐沉积、形成明显的钙结节，从而促进骨组织修复[7]。本实验结果显示，ELISA法检测健脾补肾方组血清BMP-2、TGF-β、VEGF水平及骨组织中BMP-2水平均明显高于模型组，Western blot法检测健脾补肾方组血清BMP-2、TGF-β表达量高于模型组。据此推测健脾补肾方可能通过对BMP-2和TGF-β因子的调控而促进骨髓间充质干细胞定向成骨分化而促进骨坏死修复。

综上所述，健脾补肾方可能通过调控BMP-2、TGF-β表达而促进骨髓间充质干细胞定向成骨分化，从而扭转骨坏死。但本研究为前期预实验，主要目的在于筛选可能与健脾补肾方调控股骨头坏死骨髓间充质干细胞定向分化成骨细胞相关的调节因子，为后期深入探讨健脾补肾方防治股骨头坏死的机制研究提供前期理论基础，其确切机制还需扩大样本量进一步深入研究验证。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。