小檗碱改善多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗大鼠子宫组织局部胰岛素抵抗的作用机制研究

李慕白，王婷婷，张多加，吴效科，张明明

(1. 黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150000；2. 黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150000)

多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄妇女常见的内分泌疾病，高胰岛素血症和胰岛素抵抗(IR)是PCOS患者的重要特征，临床中50%～75%的PCOS患者伴有不同程度的IR[1]。高胰岛素血症是促进高雄激素血症的原因之一，胰岛素可以协同促黄体生成素(LH)促进卵巢膜细胞雄激素的生成[2]。PCOS患者IR常伴随着血脂代谢异常，同时还增加患肥胖症、心血管疾病、2型糖尿病的风险[3]。有研究表明，PCOS患者子宫内膜局部IR可以降低子宫内膜容受性，影响妊娠率[4]，甚至可能参与女性不孕症的发展[5]，同时也增加了子宫内膜异常增生的风险[6]，因此，PCOS患者子宫内膜局部IR对生殖功能障碍和子宫内膜异常增生有重要影响。小檗碱是从中药黄连的根、茎、皮中提取的一种季铵盐，其具有良好的降血糖和降血脂作用，是一种有效的胰岛素增敏剂[7]，在改善糖脂代谢和增强胰岛素敏感性方面与二甲双胍作用相似，但其降低LH、总睾酮(T)和LH/卵泡刺激素(FSH)的作用优于二甲双胍[1]。目前研究认为小檗碱可通过调节胰岛素信号通路改善PCOS患者IR[8]，但其具体机制仍有待研究。本实验应用胰岛素联合人绒毛膜促性腺激素(HCG)建立PCOS伴IR大鼠模型，通过观察小檗碱对大鼠糖脂代谢、甾体激素水平及子宫组织胰岛素信号通路相关靶基因和GLUT4基因表达的影响，探讨了小檗碱改善PCOS全身IR及子宫组织局部IR的作用机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，鼠龄44～50 d，体重160～170 g，购自哈尔滨光大动物养殖技术中心,动物生产许可证号：SCXK(黑)2018-003。所有大鼠均适应性喂养1周，自由饮水，光照/暗时间为12 h/12 h循环，室温20～24 ℃，相对湿度50%。

1.2主要试剂 精蛋白生物合成人胰岛素注射液(丹麦诺和诺德公司，批号：J20171005)；注射用绒促性素(丽珠集团丽珠制药厂，批号：200309)；盐酸小檗碱片(东北制药集团沈阳第一制药有限公司，批号：2190612)；盐酸二甲双胍片(中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字H20023370)。大鼠INS、T、LH、FSH、雄烯二酮(ASD)、17-羟孕酮(17-OHP)、性激素结合球蛋白(SHBG)、雌激素(E2)ELISA试剂盒均购自上海舜冉生物科技有限公司。兔抗大鼠多克隆磷酸化IRS1-Ser307抗体和兔抗大鼠单克隆GSK3β抗体购自Cell Signaling Technology公司；兔抗大鼠单克隆磷酸化AKT1-S473抗体购自Abcam公司。qPCR试剂盒(KK4601)购自KAPA Biosystems公司。

1.3主要仪器 离心机(赛默飞Sorvall ST 40、SCILOGEX)，生化分析仪(迈瑞BS200)，正置光学显微镜(日本尼康NIKON ECLIPSE CI)，包埋机(武汉俊杰电子有限公司JB-P5)，酶标分析仪(Infinite F50)，电泳仪(美国BioRad POWERPAC HC POWER SUPPLY、北京君意东方电泳设备有限公司)，实时荧光定量PCR仪(ABI公司 ABI7500)。

1.4实验方法 随机将大鼠分为空白组、PCOS组、小檗碱组、二甲双胍组，每组15只。PCOS组、小檗碱组、二甲双胍组参考文献[9]采用胰岛素+HCG颈背部皮下注射方法建立PCOS伴IR模型：造模第1天，每只大鼠颈背部皮下注射胰岛素0.5IU/次，1次/d，每日增加0.5 IU，逐渐递增至6.0 IU/d，第12天后维持6.0 IU/d剂量直至造模第22天；从造模第14天开始，每只大鼠皮下注射HCG 6.0 IU/d，分2次注射，直至造模第22天。空白组给予等剂量生理盐水颈背部皮下注射。造模结束后，二甲双胍组给予二甲双胍溶液200 mg/kg灌胃，小檗碱组给予盐酸小檗碱混悬液170 mg/kg灌胃，空白组和PCOS组大鼠每日给予等容量生理盐水灌胃，均1次/d，连续31 d。

1.5.1动情周期 造模结束后，对PCOS组、小檗碱组、二甲双胍组大鼠进行阴道涂片观察阴道上皮角化程度，4 d为1个周期，连续观察3个周期；灌胃第19天开始，再次对PCOS组、小檗碱组、二甲双胍组大鼠进行阴道涂片观察阴道上皮角化程度，4 d为1个周期，连续观察3个周期。

1.5观察指标及方法

(2)试验梁跨中挠度和支座处结合面滑移：均采用位移计。在梁端支座处布置一个位移计，用来测量支座处结合面滑移，试验梁跨中处布置一个位移计用来测量跨中挠度。

1.5.2口服葡萄糖耐量试验(OGTT) 灌胃干预结束后第2天，各组大鼠禁食12 h后先空腹采血，再给予50%葡萄糖溶液3 g/kg灌胃，分别于灌胃后第60 min、120 min、180 min尾静脉取血，检测各时间段血糖水平。

1.5.3激素及血脂水平 灌胃干预结束后，禁食，次日对处于动情间期的大鼠眼眶静脉取血，全血离心后取血清置于-80 ℃冰箱，采用酶联免疫吸附法检测血清空腹胰岛素(FINS)、LH、SHBG、FSH、E2、T、ASD、17-OHP水平，采用生化法检测三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。

1.5.4子宫病理形态观察 各组大鼠采血后断颈处死，取出子宫，每只大鼠取一半子宫用10%福尔马林固定液固定，常规石蜡包埋、切片，行苏木素-伊红染色(HE)，并应用3D HISTECH软件，运用肠绒毛高度和隐窝深度测量方法测量子宫各检测位点(肌层厚度、腔上皮细胞高度、腺腔大小)。

1.5.5子宫组织中pIRS1-Ser307、pAKT-S473、GSK3β蛋白表达情况 采用Western blot法进行检测：从-80 ℃冰箱中取出各组大鼠液氮冻存的另一半子宫，按10%匀浆后取组织40 mg加入400 μL RIPA裂解液(磷酸化蛋白需同时加入磷酸酶抑制剂)，30000r/min匀浆10min，13000r/min离心20 min，取上清；用BCA法蛋白定量，上样后电泳、转膜，加入相应一抗，4 ℃孵育过夜，洗膜后室温孵育二抗40 min，化学发光法ECL显影；图片扫描，使用软件Gel Image ststem ver.4.00(tanon,china)对图像进行灰度分析。

1.5.6大鼠子宫组织中GLUT4 mRNA表达情况 使用ncbi-primer合成引物，提取样本总RNA，将1 mL TRIzol悬液剧烈振荡20 s，按比例加入氯仿，剧烈振荡15 s后室温放置2 min，12 000 r/min离心10 min，将上层水相移到新管中，并加入1倍体积的70%乙醇混匀，将得到的溶液转到Spin Column RM中，12 000 r/min离心20 s，丢弃废液，进行DNase 1消化后，将放回的Spin Column RM以12 000 r/min离心1 min，Spin Column RM转管，加30 μL RNase-free Water，室温放置1 min，12 000 r/min离心1 min；用1%琼脂糖凝胶进行电泳质检；使用HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒(康为世纪，CW2569)进行反转录；并使用ABI7500荧光定量PCR仪进行Real-time PCR；采用2-△△ct方法进行数据的相对定量分析。具体引物序列：GLUT4前向引物为5’-GGCCGGGACACTATACCCTAT-3’，反向引物为5’-GACCAGTGTCCCAGTCACTC-3’，长度138 bp；ACTb前向引物为5’-GCACCATGAAGATCAAGATCATT-3’，反向引物为5’-TAACAGTCCGCCTAGAAGCATT-3’，长度172 bp。

2 结 果

2.8各组大鼠子宫组织中GLUT4 mRNA表达情况PCOS组大鼠子宫组织中GLUT4 mRNA相对表达量明显低于空白组(P<0.05)；小檗碱组和二甲双胍组大鼠子宫组织中GLUT4 mRNA相对表达量均明显高于PCOS组(P均<0.05)，小檗碱组和二甲双胍组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。

从表1可以得出，由于主辅隔离带沿线存在空间不连续、喷洒方向与路拱横坡相反以及工程量大等缺点，对于安装喷洒装置难度更大、成本更高，安装后喷洒的预期效果也不理想。相比较而言，喷洒装置安装在空间连续、施工作业面较少的中央隔离带，不但工程量合理、施工较为方便，而且由于喷洒方向与路拱横坡一致，喷洒的效果也会更好。因此，喷洒装置安装位置应选在中央隔离带。

2.2各组大鼠OGTT各时间段血糖水平比较 PCOS组大鼠OGTT各时间段血糖均明显高于空白组(P均<0.05)；小檗碱组和二甲双胍组大鼠OGTT各时间段血糖均明显低于PCOS组(P均<0.05)，小檗碱组和二甲双胍组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 空白组和多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗各组大鼠OGTT各时间段血糖水平比较

2.7各组大鼠子宫组织中pIRS1-Ser307、pAKT-S473、GSK3β蛋白表达情况 与空白组比较，PCOS组大鼠子宫组织中pIRS1-Ser307、GSK3β蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05)，pAKT-S473蛋白相对表达量明显降低(P<0.05)；与PCOS组比较，小檗碱组和二甲双胍组大鼠子宫组织中pIRS1-Ser307、GSK3β蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)，pAKT-S473蛋白相对表达量明显升高(P<0.05)，小檗碱组和二甲双胍组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图4。

表2 空白组和多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗各组大鼠血清甾体激素水平比较

组别只数17-OHP/( x±s,ng/mL)SHBG/( x±s,nmol/L)T/( x±s,ng/dL)ASD/[M(P25,P75),nmol/L]空白组152.28±0.5358.27±3.7934.08±2.9611.25(10.58,11.46)PCOS组153.56±0.74①33.14±4.82①50.20±12.29①20.44(19.55,20.73)①小檗碱组152.80±0.36②47.72±2.55②③39.05±1.72②14.29(14.16,14.79)②③二甲双胍组152.82±0.33②42.62±3.16②43.11±4.16②16.65(16.48,17.25)②

2.4各组大鼠血清FINS、HOMA-IR及血脂指标比较 PCOS组大鼠血清FINS、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C水平均明显高于空白组(P均<0.05)，HDL-C水平明显低于空白组(P<0.05)。小檗碱组和二甲双胍组大鼠血清FINS、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C水平均明显低于PCOS组(P均<0.05)，HDL-C水平与PCOS组比较差异无统计学意义(P均>0.05)；小檗碱组大鼠血清FINS水平明显低于二甲双胍组(P<0.05)，HOMA-IR、TG、TC、LDL-C、HDL-C水平与二甲双胍组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

根据本条规定，一是公布评估师名单的主体是有关全国性评估行业协会。二是公布的评估师名单应当包括所有通过有关专业类别评估师资格的评估专业人员。三是评估师名单应当实时更新，例如应当及时补充新通过资格考试的评估师，对已经死亡或者丧失民事行为能力的评估师，应当及时从名单中去除。四是有关全国性评估行业协会应当在其网站上公布评估师名单，便于委托人和社会公众查询。

表3 空白组和多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗各组大鼠血清FINS、HOMA-IR及血脂指标比较

2.5各组大鼠子宫形态学表现 空白组大鼠子宫腔上皮细胞呈单层柱状，未见空泡；子宫腺腔未见扩张，腺腔内无分泌液；子宫肌层厚度正常。PCOS组大鼠子宫腔上皮细胞高度增加，细胞质与细胞核比例增高，可见假复层，少量上皮细胞胞质空泡化；可见少量子宫腺扩张；子宫肌层厚度增加。与PCOS组相比，小檗碱组和二甲双胍组子宫腔局部上皮细胞高度降低，未见假复层，上皮细胞胞质未见空泡；子宫腺腔未见扩张；子宫肌层厚度变薄。见图1～3。

推荐理由:本书为原中国残疾人联合会副主席王新宪回忆录。文稿叙述平实感人，按时间顺序记述了作者从1968年至2000年之间的生活和工作经历，即从中学时代到进入社会，从工厂劳动至残联工作的一段人生历程。作者虽然从小就身体不便，但行文中却没有一丝怨天尤人和对人生及社会的不满，整篇文稿都充满了积极向上的正能量和对亲人朋友的感激之情。

图1 空白组和多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗各组大鼠子宫腔上皮细胞HE染色表现(×400)

图2 空白组和多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗各组大鼠子宫腺腔HE染色表现(×400)

图3 空白组和多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗各组大鼠肌层厚度HE染色表现(×100)

2.6各组大鼠子宫肌层厚度、腔上皮细胞高度和腺腔大小比较 PCOS组大鼠子宫肌层厚度、腔上皮细胞高度和腺腔大小均明显高于空白组(P均<0.05)；小檗碱组和二甲双胍组大鼠子宫肌层厚度、腔上皮细胞高度和腺腔大小均明显低于PCOS组(P均<0.05)，小檗碱组和二甲双胍组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表4。

表4 空白组和多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗各组大鼠子宫肌层厚度、腔上皮细胞高度和腺腔大小比较[M(P25，P75)]

2.3各组大鼠血清甾体激素水平比较 与空白组比较，PCOS组大鼠血清LH、17-OHP、T、ASD水平和LH/FSH均明显升高(P均<0.05)，SHBG水平明显降低(P<0.05)。与PCOS组比较，小檗碱组和二甲双胍组大鼠血清LH、17-OHP、T、ASD水平和LH/FSH均明显降低(P均<0.05)，SHBG水平均明显升高(P<0.05)；与二甲双胍组比较，小檗碱组大鼠血清LH、ASD水平更低(P均<0.05)，SHBG水平更高(P<0.05)；各组大鼠血清FSH、E2水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

图4 空白组和多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗各组大鼠子宫组织胰岛素信号通路相关靶基因蛋白表达情况

2.1各组大鼠动情周期 造模结束后，光镜下观察可见大鼠阴道上皮细胞持续处于以大量白细胞为主的动情间期，提示造模后大鼠动情周期紊乱，造模成功。小檗碱组和二甲双胍组大鼠灌胃19 d后阴道涂片可见以角化上皮细胞为主的动情期，逐渐恢复4～5 d的正常动情周期。

下丘脑-垂体功能障碍是PCOS的病因之一[18]，下丘脑Kisspeptin是内分泌和代谢信号的靶标[19]。Esparza等[20]报道，PCOS小鼠Kisspeptin信号水平升高，血清LH增加。张多加等[21]研究发现，PCOS患者血清中Kisspeptin浓度和脉冲频率明显升高，而Kisspeptin对葡萄糖刺激的胰岛素分泌有促进作用，小檗碱可能通过下丘脑-垂体轴降低血清LH水平，进而改善PCOS生殖内分泌紊乱。本实验结果显示，小檗碱组和二甲双胍组大鼠血清LH、17-OHP、T、ASD水平和LH/FSH均明显低于PCOS组，SHBG水平均明显高于PCOS组；且小檗碱组大鼠血清LH、ASD水平明显低于二甲双胍组，SHBG水平明显高于PCOS组。提示小檗碱可明显改善PCOS伴IR大鼠的生殖内分泌紊乱。

图5 空白组和多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗各组大鼠子宫组织中GLUT4 mRNA相对表达量

3 讨 论

IR作为PCOS患者的特征之一，可导致PCOS患者出现肥胖、多毛、痤疮、黑棘皮、不孕等临床特征，增加PCOS患者患2型糖尿病的风险[10]。有研究发现，在胰岛素联合HCG的干预下，成年大鼠出现卵泡囊性扩张[11]、卵巢局部组织IR[12]、糖代谢障碍和高胰岛素血症等PCOS特征，且还能导致大鼠卵巢和子宫出现形态改变和功能障碍[13]。本实验结果显示，造模后大鼠动情周期和糖脂代谢紊乱，LH/FSH和HOMA-IR均明显增高，大鼠出现高雄激素血症，子宫出现形态学改变，pIRS1-Ser307高表达，证实胰岛素联合HCG法造模的大鼠呈现PCOS伴IR状态。

小檗碱对PCOS患者生殖功能具有改善作用，可调节月经周期，其诱导排卵的效果达到一线促排卵药克罗米芬的水平[14-15]。小檗碱还可通过调节下丘脑-垂体-卵巢轴(HPOA)减少类固醇激素的合成和卵巢芳香化酶的表达[16]，改善PCOS患者的IR状态，减轻体重[17]。临床观察发现小檗碱不良反应短暂且温和，在PCOS患者的长期治疗中具有安全性，具有广阔的应用前景[14]。

由于室内外会有较大温差的存在，所以导致建筑在使用过程中，由于外围护结构是直接和外界接触的，彼此之间会存在热传导的情况。在这种情况下，围护结构中的一些部位如果对应的传导系数存在差异，则很容易发生外部温度较高，材料内部温度较低的情况。在这种情况下，热传导很难快速完成，所以在热传导的过程中就会有能量损失的情况发生。也正是因为如此，所以有一些建筑在使用过程中会有较大的能耗出现。

小说的创作离不开“时空”，也离不开小说故事情节的授予者，即小说中的人物。空间叙事的手法虽然学界没有明确界定，但从《山本》的创作可以发现三类空间叙事创作手法的痕迹，即空间并置叙事、人物塑造的空间表征法以及空间叙事的另类表达——图像叙事三种手法。通过结合文本对三种空间叙事的手法分析，利于进一步研究空间叙事在《山本》中呈现的状况。

PCOS患者多存在糖脂代谢紊乱及高胰岛素血症。本实验结果显示，PCOS组大鼠血清FINS、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C水平均明显高于空白组，HDL-C水平明显低于空白组，证实PCOS伴IR大鼠存在明显高胰岛素血症和糖脂代谢紊乱；小檗碱组大鼠血清FINS、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C水平均明显低于PCOS组，说明小檗碱可明显改善PCOS伴IR大鼠高胰岛素血症和糖脂代谢紊乱。

（2）冻融损害。冻融损害主要发生在寒冷地区的春融季节，路面结构中滞留的水在冬季环境温度作用下凝固成冰，体积膨胀，影响沥青路面的骨架结构以及沥青与石料的黏附性，导致沥青面层粒料的脱落，形成松散、麻面等病害。而当环境温度升高时，结构层中的冰融化成水，在交通荷载的重复作用下，原有的病害扩展速度加剧，最终形成坑槽。

IR作为PCOS的代谢特征，可影响PCOS患者子宫内膜容受性[3]。IR可导致葡萄糖转运蛋白表达水平降低，致使子宫内膜细胞葡萄糖供应不足，从而引起子宫内膜发育障碍[22]，而且IR引起的雄激素过多可以通过干扰葡萄糖代谢来抑制子宫内膜细胞的生长和活性，从而抑制蜕膜的分化[3]。本实验结果显示，POCS组大鼠子宫腔上皮细胞高度增加、肌层增厚和腺体扩张，提示胰岛素联合HCG造模的PCOS伴IR大鼠子宫组织具有增生趋势；小檗碱组大鼠子宫腔上皮细胞高度降低，肌层变薄，未见腺体扩张，证明小檗碱可以改善PCOS伴IR大鼠子宫异常增生状态。哺乳动物雷帕霉素(mTOR)是AMPK的下游靶标之一，参与细胞增殖，mTOR活性增加可导致子宫内膜增生[23]，AMPK的激活可以抑制mTOR通路，抑制子宫内膜细胞的增殖[24]。IRS是mTOR的下游成分，mTOR能够磷酸化IRS蛋白在胰岛素信号传导途径中的几个残基，从而影响胰岛素信号传导，mTOR被抑制后可以诱导IRS1表达，并消除PI3K/AKT/mTOR途径的反馈抑制作用，激活AKT，降低细胞增殖活性[25]。故本研究认为小檗碱是通过AMPK途径，抑制胰岛素信号通路上的增殖基因mTOR，并激活上游胰岛素信号通路，从而逆转子宫形态异常增生。

研究发现PCOS患者的PI3K/AKT胰岛素信号通路出现传导障碍，GSK3β活性升高，AKT活性降低，糖原合成异常，胰岛素对葡萄糖转运作用下降，导致糖代谢障碍，出现IR[26]；而AKT的活性与GLUT4的表达有关，GLUT4低表达可影响子宫内膜营养供应[27]。本实验结果显示，PCOS组大鼠子宫组织中pIRS1-Ser307、GSK3β蛋白相对表达量均明显升高，pAKT-S473蛋白和GLUT4 mRNA相对表达量明显降低，提示子宫细胞糖代谢能力受损；与PCOS组比较，小檗碱组和二甲双胍组大鼠子宫组织中pIRS1-Ser307、GSK3β蛋白相对表达量均明显降低，pAKT-S473蛋白和GLUT4 mRNA相对表达量明显升高，提示小檗碱可以调节IRS1/PI3K/AKT/GLUT4途径，促进葡萄糖转运，改善PCOS高胰岛素血症、IR及子宫内膜容受性。

综上所述，小檗碱不仅能改善PCOS伴IR大鼠高胰岛素血症和糖脂代谢及生殖代谢紊乱，还可调节大鼠子宫胰岛素信号通路IRS1、AKT、GSK3β和GLUT4的表达，改善子宫局部IR，从而改善子宫内膜容受性和子宫异常增生状态。

3.朗读课文。在课前，学生一般都不太明白该怎么学习语文，因此，可以通过预习，让学生把课文读熟，甚至能够朗诵，从而使学生在进行课文朗诵时了解课文的内容，并对课文内容有所体会。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。