孕期和哺乳期暴露重铬酸钾对仔鼠卵巢损伤的影响*

管庆美，刘燕群,△，吴 倩，林可欣，鲁雄兵，张 龙，陈路锋

(1.江汉大学医学院,湖北 武汉 430056；2.江汉大学持久性有毒污染物环境与健康危害湖北省重点实验室,湖北 武汉 430056)

铬一直被认为是人和动物的必需微量元素，也被广泛用于金属冶炼、皮革制造、化妆品生产、人工关节等各个行业。然而铬也是环境重金属污染物，可通过多种途径蓄积于体内，造成机体损伤。在不同价态铬之间以六价铬毒性作用尤为严重[1-2]。六价铬也被WHO定为人类确定致癌物，过量摄入铬会造成肝脏、肾脏、骨骼、皮肤、神经系统损伤[3-7]，甚至有致癌、致突变等不良影响，并且重铬酸钾对胚胎、子一代机体损伤也已被证实[8-9]。然而重铬酸钾对子一代生殖器官损伤的研究甚少见，具体机制尚不明确。因六价铬可穿过细胞膜，且具有强氧化性，可损伤卵黄囊，也可穿过胎盘屏障，且母乳喂养也可传播铬离子，合并对仔鼠造成脏器损伤[10-11]。提示六价铬宫内暴露会对雌性仔鼠卵巢产生氧化应激效应，造成潜在的生殖发育毒性。故本研究建立了重铬酸钾染毒模型，观察了对子一代雌鼠的氧化损伤效应。SD大鼠因其具有个体差异小、试验数据较准确等优点,广泛用于动物实验研究[12]。本研究选用SD大鼠，通过将妊娠期、哺乳期雌性大鼠暴露于不同浓度重铬酸钾，观察了子一代雌性仔鼠性成熟时期卵巢的氧化应激水平，对母鼠孕期和哺乳期暴露重铬酸钾对子一代仔鼠卵巢氧化损伤的影响进行了初步探讨，旨在为重金属致子一代雌性仔鼠生殖毒性的进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 2019年6月选取无特定病原体级SD大鼠雌性23只，雄性10只，均购于北京维通利华实验动物技术有限公司(合格证号：1100111911015206)。大鼠毛发浓密有光泽，身体状况良好。将大鼠雌雄分开并置于室内(24±1)℃适应性喂养1周。

1.1.2仪器与试剂 重铬酸钾产于山东西亚化学股份有限公司，纯度99.8%；JA2003B电子天平购自上海越平科学仪器有限公司，XD-202倒置生物显微镜购自南京江南永新，离心机购自上海越平科学仪器有限公司，台式离心机(TGL-16C)、纯水仪(AJC-0501-P)、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测试盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2方法

1.2.1配制重铬酸钾染毒液 准确称取适量重铬酸钾配制成1/2、1/4、1/8 LD50重铬酸钾溶液分装至氯化聚氯乙烯管中，置于冰箱(4 ℃)保存，以供低、中、高浓度染毒组灌胃使用。

1.2.2实验动物分组与实验方法

1.2.2.1预实验 因六价铬LD50浓度为171.00 mg/kg[13]。故设置1/2 LD50(85.5 mg/kg)、1/4 LD50(42.75 mg/kg)、1/8 LD50(21.375 mg/kg)浓度染毒组及生理盐水对照组。每组2只雌鼠，1只雄鼠。在适应性喂养结束后于09：00合笼，雌雄比例为2∶1。第2天09：00进行阴道涂片检测雌鼠是否成功受孕。以显微镜下观察到精子为妊娠第0天并记录体重，第1天起开始灌胃。各组孕鼠按0.01 mL/g剂量灌胃,从孕1～19 d每天上午08：30称重后根据体重调整剂量，每天灌胃剂量一次性完成，自由饮水、进食，直至生出仔鼠后断奶。断奶后对仔鼠进行观察，断头取血，并取其卵巢，滤纸脱水，称重，分析确定正式实验重铬酸钾浓度。

1.2.2.2正式实验 根据预实验结果，1/2、1/4、1/8 LD50重铬酸钾溶液对卵巢具有一定影响，且老鼠存活率较高。故正式实验依旧采用此浓度重铬酸钾溶液。根据预实验方法将雌鼠分为低(1/8 LD50)、中(1/4 LD50)、高(1/2 LD50) 浓度染毒组(各4只)和对照组(3只)。 将大鼠按雌雄比例2∶1合笼，按预实验方法测定雌鼠妊娠日期并记录，并于妊娠第1天起按0.01 mL/g剂量开始灌胃，每天1次，连续灌胃至仔鼠出生后断奶(19 d)。对照组仔鼠(不分雌雄)27只,低浓度染毒组37只,中浓度染毒组33只,高浓度染毒组48只。每组挑取体重、毛色、生理状态相似的8只雌性仔鼠继续喂养(自由饮水、进食)至45 d(性成熟)后称重、麻醉剖取卵巢组织，滤纸脱水，称重计算脏器系数。每组取6只雌性仔鼠测定卵巢组织匀浆SOD 、GSH-Px 活力。

1.2.3观察指标

1.2.3.1仔鼠体重、卵巢重量及脏器系数 各组仔鼠出生45 d使用7%水合氯醛麻醉，称重并处死仔鼠，迅速分离双侧卵巢组织，用滤纸吸干，进行称量并计算卵巢系数(卵巢重量/体重×100%)。

1.2.3.2卵巢SOD、GSH-Px活力 称取各组仔鼠适量卵巢组织用9倍匀浆介质研磨，然后将研磨液3 000～4 000 r/min离心10 min，用移液枪取上清液制备成10%组织匀浆，各试剂反应时间与剂量和操作步骤严格按试剂盒说明书操作，采用分光光度法测定SOD、GSH-Px活力。

2 结 果

2.1各组仔鼠一般情况比较 对照组仔鼠精神状态良好，毛色正常，活泼好动，反应迅速，食欲正常，体重不断增加，无明显异常情况。随染毒时间延长，中、高浓度染毒组仔鼠食欲减退，较为安静，体重增长缓慢，较对照组低；仔鼠毛色由纯白、有光泽变得偏黄、无光泽，且以高浓度染毒组最为明显。

2.2各组仔鼠体重、卵巢重量及脏器系数比较 与对照组比较，低浓度染毒组仔鼠体重较高，而中、高浓度染毒组仔鼠体重明显较低，且高浓度染毒组较为明显，不同浓度染毒组仔鼠卵巢系数均明显降低，且随染毒浓度升高仔鼠卵巢重量及脏器系数均呈下降趋势，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组仔鼠体重、卵巢重量及脏器系数比较

2.3各组仔鼠卵巢组织SOD、GSH-Px活力比较 与对照组比较，中、高浓度染毒组仔鼠卵巢 GSH-Px活力明显降低，不同浓度染毒组仔鼠卵巢SOD活力均明显降低,且随染毒浓度升高仔鼠SOD、GSH-Px活力均呈下降趋势，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组仔鼠卵巢组织SOD、GSH-Px活力比较

3 讨 论

卵巢是卵泡的生长、发育场所，其受损必将影响生殖能力。实验动物的脏器系数可反映毒物对动物某脏器的综合毒性损伤作用，脏器系数下降表示脏器萎缩和退行性病变[14]。本研究结果显示，与对照组比较，中、高浓度染毒组仔鼠体重较轻，以高浓度染毒组较为明显。且不同浓度染毒组仔鼠卵巢重量及系数均明显下降，且以高浓度染毒组最为明显，说明重铬酸钾孕期、哺乳期暴露对仔鼠生殖发育造成了毒性损伤。

活性氧歧化物是超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢及其中间代谢产物的总称,在细胞内含量高低反映了细胞内氧化应激的水平。六价铬可使机体产生大量活性氧歧化物[15],内源性抗氧化剂——SOD、GSH-Px是机体抗氧化防御系统的重要组成部分，SOD能清除超氧阴离子自由基,将其歧化为氧气和过氧化氢,被称为生物体抗氧化系统的第一道防线；作为抵御氧化损伤的第二道防线的GSH-Px能进一步将过氧化氢转化成水和氧气,保护细胞膜结构及功能不受过氧化物的干扰及损害[16]。因此，测定SOD、GSH-Px活力能间接反映生物体内清除活性氧的能力。本研究结果显示，与对照组比较，中、高浓度染毒组仔鼠卵巢GSH-Px活力明显降低，不同浓度染毒组小鼠卵巢SOD活力均明显降低，提示铬进入细胞膜后其强氧化性引发氧化应激产生了大量氧自由基，超出了机体清除能力，SOD、GSH-Px活力下降,致使组织受到活性氧攻击而产生损伤。

综上所述，重铬酸钾孕期、哺乳期暴露可致仔鼠卵巢发生不同程度氧化损伤，但对雌性生殖系统的具体机制尚需进一步探讨，仍需加强这方面的研究。