一例鸡金黄色葡萄球菌感染的分离与药敏试验

岑明珠，张辉华

（佛山科学技术学院，广东 佛山 528200）

葡萄球菌在自然界中分布广泛，在健康禽类的皮肤、眼睑、黏膜、胃肠道都有葡萄球菌的存在，同时也存在于禽类养殖场、孵化场、饲料加工厂等。葡萄球菌多数为非致病菌，少数致病性葡萄球菌可以穿过皮肤或黏膜引起发病。葡萄球菌是一种共生细菌，具有致病性，是非常广泛的化脓性细菌之一，葡萄球菌有可能引起75%～85%的化脓性疾病，会引起禽类的组织器官受感染以及化脓，严重时可引起脓毒败血症。另外，在养殖生产中由于抗生素的频繁使用，金黄色葡萄球菌的耐药感染一直备受关注[1]，大量抗生素应用于集约化养殖场，导致耐药菌株逐渐出现，耐药谱不断扩大，有效的敏感药物日渐减少，使得该病一旦发病难以控制，给养殖业带来一定损失，因此选择合适敏感的药物显得尤为重要。

1 材料与方法

1.1 病料来源

病死鸡只来源于福建省地区养殖场的病鸡，病料具体背景信息如表1所示。

表1 病料的背景信息

1.2 试验试剂

LB琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司）、LB肉汤（广东环凯微生物科技有限公司）、MH琼脂（广东环凯微生物科技有限公司）；药敏试纸（广州市迪景微生物有限公司）；细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）。

50 × TAE缓冲液制备：称取Tris 121 g、Na2EDTA·2H2O（372 g/mol）9.3 g、冰醋酸28.55 mL、NaOH 1.55 g，加入蒸馏水定容至500 mL，常温保存备用。

1×TAE缓冲液制备：10 mL50×TAE缓冲液，加去离子水至500 mL。

1%琼脂糖凝胶制备：称取1 g琼脂糖，加入含有100 mL 1 × TAE缓冲液，于微波炉中加热融化至液体澄清透亮并冷却至40～ 60 ℃后加入5 μL核酸染料，混匀后倒入放有凝胶板的凝胶盘中（胶板厚度约5 mm，根据样品数量选择对应梳子），胶冷却凝固后拔出梳子，将电泳凝胶水平放入电泳槽中，加入1×TAE缓冲液淹没凝胶液面。

1.3 主要仪器

高速离心机（美国Thermo公司）、PCR仪（美国Thermo公司）、生物安全柜（美国Thermo公司）、恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、凝胶成像系统（北京荣阳经典科技有限公司）、高压灭菌锅（日本Tomy公司）、凝胶电泳装置（北京荣阳经典科技有限公司）。

1.4 金黄色葡萄球菌的分离纯化

1.4.1 病料的采集

先将病死鸡剖解，观察以及记录病变部位和情况，用一次性无菌接种环采集鸡的关节、骨髓、肝脏等部位。

1.4.2 细菌的分离

将采集到的关节渗出液、骨髓、肝脏等用LB普通琼脂培养基进行三分区划板，然后放置于37 ℃恒温培养箱中培养12 h。

1.4.3 细菌的增殖及收获

细菌放置在37 ℃恒温培养箱培养12 h后，每种细菌挑平板上的单菌落进行革兰氏染色，显微镜下观察细菌形态，将分离菌进行单菌落划线，用普通LB肉汤放置在37 ℃恒温培养箱中存放，培养12 h纯化后进行鉴定。最后培养过的分离菌暂时存放在-4 ℃冰箱中。

1.4.4 染色镜检

将疑似的菌株进行染色镜检：取洁净的载玻片于火焰上反复拖拉几次，用移液枪取10 μL蒸馏水，用接种环挑取菌落边缘少许细菌，与玻板上的蒸馏水混匀涂抹开，悬于火焰上方，火焰固定；滴加结晶紫染色液计时1 min后水洗；滴加碘液计时1 min后水洗；滴加脱色酒精，计时约30 s后水洗；滴加沙黄复染液，复染1 min后水洗晾干，转到光学显微镜下，选择合适放大倍数观察细菌的形态。

1.5 细菌的PCR鉴定

1.5.1 引物的设计与合成

上游引物27F序列：AGTTTGATCMTGGCTCAG，下游引物1492R序列：GGTTACCTTGTTACGACTT，引物由广州擎科生物科技有限公司合成。

1.5.2 细菌的DNA提取

按照DNA提取试剂盒说明书对细菌基因组进行抽提，将抽提所得产物收集于2 mL离心管中，短期存于4 ℃，长期存于-20 ℃备用。

按照擎科生物科技有限公司的试剂盒说明书进行，在生物安全柜中配置25 μL的PCR体系，具体包括：上游引物PF（10P）1 μL，下游引物PR（10P）1 μL，模板gDNA 1 μL，蒸馏水H2O 22 μL。将混匀的上述液体放入PCR仪中进行PCR扩增，该体系的反应如下：98 ℃预变性5 min，98 ℃变性10 s，55 ℃复性15 s，72 ℃延伸15 s。以上进行35个循环，然后72 ℃后延伸5 min。

1.5.3 琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶点样：取20 μL PCR扩增产物加入各加样孔中，并加入对应的阴性对照与阳性对照，同时设定标准分子量Maker做分子质量大小对照。

结果观察和判断：电泳结束后，关闭电源，把凝胶从电泳液中取出来，放入凝胶成像系统中，UV紫外灯下观察核酸条带并读取结果。

1.5.4 药敏试验

参照常规K -B药敏试纸扩散法对分离的菌株进行药敏试验，对照菌株为金黄色葡萄球菌26003。取金黄色葡萄球菌新鲜培养肉汤，调整菌液浓度为1.0 × 106cfu/mL，蘸取菌液在MH平板上均匀涂抹，每次涂抹将平板旋转60°，最后沿平板周边绕转2圈，保证涂抹均匀；待平板水分被完全吸收后，夹取一张药敏试纸，放于平板表面，轻轻按压使其贴平，重复2个平行，置于37 ℃培养18～24 h，观察结果。

2 结果

2.1 剖检结果

经剖检可见，鸡只脚关节发炎肿胀充血，爪掌出现溃烂呈乌黑色痂，趾关节肿胀（如图1）。

图1 病变情况

2.2 分离菌的形态结果

分离所得菌株通过平板划线细菌分离、单菌落纯化后，得到的分离菌株在LB琼脂培养基上为灰白色菌落，表面光滑、湿润、圆形有隆起，革兰氏染色呈蓝紫色，无芽孢，葡萄状菌落形态，初步鉴定为葡萄球菌。

2.3 分离菌PCR结果

对待检分离菌以所提菌株DNA作为模板进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析后，通过与DNA Marker条带对比（图2），特异性DNA条带约为1 500 bp，与预期目的基因大小相符，将纯化的PCR产物外送测序，将序列在NCBI中进行Blast比对，确认分离株属于葡萄球菌属。

图2 PCR鉴定

2.3 药物敏感性结果

17种药物试验的敏感度结果如表2所示，分离得到的金黄色葡萄球菌株对萘啶酸、磺胺复合物、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星表现耐药（R），对四环素、青霉素、氨苄西林表现中敏（I），对阿莫西林、链霉素、甲氧苄胺嘧啶、阿米卡星、庆大霉素、磺胺甲恶唑、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟均表现敏感（S）。

表2 药敏试验结果

3 结果与讨论

金黄色葡萄球菌对抗生素的耐药性不断提高，耐药菌株日益增多，已被公认为家禽和人类健康面临感染的最大威胁之一，也是一个重大的公共卫生问题。若发现该耐药菌株引起的感染，应及时采取有力措施加以控制并加强耐药性监测[2]。本研究采用了分子生物学鉴定方法，相较于传统细菌鉴定方法简单快速，通过基因序列同源性比较，能更准确的将不同的细菌区分开来。此次在鸡病料中分离所得的1株致病性菌株通过革兰氏染色镜检鉴定，结果显示为革兰氏阳性菌，呈蓝紫色球状菌，符合金黄色葡萄球菌的革兰氏染色特征。经细菌基因组DNA提取后进行PCR扩增，产物经凝胶成像系统得到清晰可见单一透亮的条带，片段在1 500 bp左右，再通过测序所得序列在NCBI中进行Blast比对，确认分离株属于葡萄球菌属，为致病性金黄色葡萄球菌。

在本次药敏试验中，结果显示该菌株对萘啶酸、磺胺复合物、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星表现耐药（R），对四环素、青霉素、氨苄西林表现中敏（I），对阿莫西林、链霉素、甲氧苄胺嘧啶、阿米卡星、庆大霉素、磺胺甲恶唑、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟均表现敏感（S）。所以福建地区该养殖场在发病之后为达到控制效果，应选用敏感性较高的阿莫西林、链霉素、甲氧苄胺嘧啶、阿米卡星、庆大霉素、磺胺甲恶唑、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟，避免使用萘啶酸、磺胺复合物、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星等耐药性药物，以免造成抗生素泛滥使用以及增加养殖成本。养殖场在使用抗生素的过程中，注意交替用药，不要一直使用单一抗生素，以免日后造成菌株新的耐药性。

鸡葡萄球菌的生物膜形成会在人体内引起感染，在家禽上虽然不是常见病和多发病，但一旦发病就特别严重[3]，它可引起畜禽各种化脓性疾病，如鸡的华农性关节炎，牛科动物的急性或慢性乳腺炎，猪的流产和皮炎，马属动物的创伤感染、脓肿、蜂窝织炎等，对畜牧业危害巨大[4]。因它是体表的常在菌，在正常情况下，不会感染机体，但是当出现伤口时，比如注射疫苗、网刺、断喙、扭伤和刮伤等都可以成为本病发生的诱因，另外，当由于长途运输、室温或气温变冷、改变饲养方式、通风不良、高温高湿以及其他疾病的继发性导致鸡只受到应激或造成机体免疫力下降都可引发此病，鸡葡萄球菌病的发生常常与饲养管理水平、饲养密度和环境洁净度有直接关系，有关养殖场管理者应当做好预防工作，加强饲养管理，尽量减少或防止诱因的出现，保持鸡群良好的精神状态，鸡舍应通风良好且有适宜的光照，维持合适的温度和湿度，注意清除有可能导致鸡外伤的因素，防止鸡只因外伤增加感染此病的概率，防患于未然。

4 结论

（1）从福建地区该养殖场病料中分离所得菌株经鉴定为金黄色葡萄球菌。（2）通过药敏试验结果可知，该菌的耐受药物为萘啶酸、磺胺复合物、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星，敏感药物为阿莫西林、链霉素、甲氧苄胺嘧啶、阿米卡星、庆大霉素、磺胺甲恶唑、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟。（3）福建地区该养殖场在发病之后为达到控制效果，应选用敏感性较高的阿莫西林、链霉素、甲氧苄胺嘧啶、阿米卡星、庆大霉素、磺胺甲恶唑、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟，避免使用萘啶酸、磺胺复合物、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星等耐药性药物。