硫胺素联合叶酸治疗维持性血液透析患者认知损害的研究

曾小君 谢可炜 李 萍 刘 上 仇 婷 颜佳毅 潘舒婷 林 岩 袁江姿 庞慧华 张伟明 顾乐怡 陆任华

终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)是一项全球关注的公共医疗卫生问题。2018年，美国肾脏病数据系统(United States Renal Data System，USRDS)显示，ESRD的发病率约为373.4/100万人[1]。截至2030年，亚洲地区透析患者预计将增至216.2万人[2]。认知损害(cognitive impairment，CI)是ESRD患者常见的神经系统并发症之一[3-5]。本研究团队前期的单中心、队列观察性研究[6]应用蒙特利尔认知评估量表(Montreal Cognitive Assessment，MoCA量表)评估接受维持性血液透析(maintenance hemodialysis，MHD)的ESRD患者是否伴有认知功能损害，结果显示，ESRD患者中CI的发病率为51.6%，较非肾脏病患者显著增加3倍；研究还发现，伴有CI行MHD患者的3年存活率显著低于认知功能正常的同类患者，这需引起医学界的广泛关注。

ESRD人群中CI的发生与氧化应激关系密切[3]。研究[7-8]结果表明，硫胺素作为转酮醇酶的辅助因子，在减少神经系统活性氧(reactive oxygen species, ROS)产生，减轻氧化应激反应中发挥重要作用。叶酸具有直接的抗氧化效应，通过与内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)相互作用，影响NO辅助因子的生物利用度。叶酸是同型半胱氨酸代谢为甲硫氨酸的必需物质，可降低同型半胱氨酸水平[9]。动物研究[10]发现，硫胺素和叶酸缺乏与氧化应激相关标志物(包括丙二醛、蛋白羰基、8-羟基脱氧鸟苷和NO等)水平的升高密切相关，可促使CI的发生。临床研究[9-11]结果表明，补充硫胺素或叶酸均可降低血液中包括同型半胱氨酸在内的氧化应激标志物水平，为MHD患者带来心血管获益[11]，尤其是对于行强化治疗(如大剂量使用或联合使用维生素B类药物)或血同型半胱氨酸水平下降幅度超过20%的患者。

本项前瞻性、随机、对照、开放标签的单中心研究旨在探讨两种维生素B(硫胺素和叶酸)的联合治疗是否可显著改善行MHD继发CI患者的MoCA量表评分与疾病预后。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2000—2016年在上海交通大学医学院附属仁济医院行MHD患者的临床资料。纳入标准：年龄18～80岁，性别不限；行MHD时间≥3个月；伴有CI，定义为MoCA量表评分<26分，如患者受教育年限<12年，定义为MoCA量表评分<25分[4-5]。排除标准：患者病史资料丢失或不全；不能配合完成研究者；预计生存期限<1年者；3个月内参加过其他临床试验者；有严重贫血、感染、肿瘤、活动性出血或心、肝、肺疾病者；硫胺素和叶酸过敏者；罹患引起认知障碍的疾病，如部分脑血管疾病；妊娠或哺乳期妇女；研究者判断不适合入选本研究者。本研究已通过医院伦理委员会的审核、批准(批准号为仁济伦审[2017]028号)，所有受试者在入选前均已签署知情同意书。该研究已在中国临床试验注册中心注册(注册号：ChiCTR-IPR-17012210)。

1.2 方法 本研究设计为前瞻性、随机、对照、开放标签、单中心研究。应用SAS(9.3版)独立数据管理器生成随机化序列，存储于密封、不透明的信封中。若患者同意参加研究，研究人员即打开一个信封以获得治疗分配，根据随机号以1∶1随机分为两组。共50例符合入排标准的MHD患者被纳入本研究(入组时间为2017年)；随机分为治疗组和对照组，每组各25例。对照组不予任何干预；治疗组给予硫胺素(90 mg/d，即30 mg/次，3次/d口服；山西汾河制药有限公司，规格10 mg/片)联合叶酸(30 mg/d，10 mg/次，3次/d口服；常州制药厂有限公司，规格5 mg/片)强化治疗。

1.3 观察指标

1.3.1 资料收集 ①受试者人口学资料：年龄、性别、身高、受教育程度(受教育年限≥12年或<12年)和CI家族史。②受试者既往史：ESRD病因、高血压史、糖尿病史、心血管疾病史、脑血管疾病史、肝硬化史、COPD史。日平均尿量和透析龄。③受试者基线期、随访48周和96周相关资料：透析时长、透析频率、透析方式 [血液透析(hemodialysis，HD)或血液透析滤过(hemodiafiltration，HDF)，以何种治疗为主(如1周2次HD联合1次HDF，即以HD为主)]；透析用血管通路为内瘘或插管；透析期间是否出现低血压[收缩压<90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)或舒张压<60 mmHg]；透析前后体重、血压和心率。④受试者基线期、随访48周和96周实验室检查结果：血红蛋白(Hb)、ALT、AST、白蛋白(Alb)、TC、TG、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、血钙、血磷、全段甲状旁腺激素(iPTH)、CRP、β2微球蛋白(β2-MG)、脑钠肽(BNP)，以及硫胺素、叶酸和同型半胱氨酸水平。⑤计算受试者透析充分性[即单室模型尿素清除指数(spKt/V)]，以及基线期、随访48周和96周的MoCA量表评分。

1.3.2 疗效评价 主要疗效评价指标：受试者基线期和随访96周时的MoCA量表评分。次要疗效评价指标：受试者基线期和随访96周时的血硫胺素、叶酸和同型半胱氨酸水平；随访96周时的生存情况。安全性指标：研究期间不良事件的发生率。

1.3.3 CI诊断 应用MoCA量表[5]北京版(2006年8月26日)对受试者行认知功能评估。该评估由经专业培训的神经内科研究人员进行，在患者行HD前或开始1 h内完成。受试者的随机分组结果对行评估人员保密。MoCA量表评分<26分(如果受教育年限<12年，MoCA量表评分<25分)则判定发生CI[4-5]。

2 结 果

2.1 两组基线期一般资料比较 两组间患者的基线期人口学资料、各既往史患者比例、HD相关资料和MoCA量表评分的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表1、2。基线期实验室检查结果显示，除治疗组血磷水平显著高于对照组(P<0.05)外，两组间其他指标的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表3。

表1 两组基线期人口学资料和既往史的比较 (N=25)

表2 两组基线期HD相关资料的比较 (N=25)

表3 两组基线期实验室检查结果的比较 (N=25)

2.2 两组随访期间HD相关资料和实验室检查结果比较 随访至48周时，治疗组患者为24例，对照组为21例；随访至96周时，治疗组患者为22例，对照组为16例。随访48周和96周时，两组间患者HD相关资料和实验室检查结果的比较差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表4、5。

表4 两组随访期间HD相关资料的比较

表5 两组随访期间实验室检查结果的比较

2.3 两组基线期和随访96周时疗效指标比较 随访96周时，治疗组患者的MoCA量表评分和血叶酸水平均显著高于同组基线期(t=6.86、5.67，P值均<0.001)。组间分析显示，随访96周时治疗组患者的MoCA量表评分、血硫胺素和血叶酸水平均显著高于对照组同时间点(F=44.89、7.29、24.31，P值均<0.01)，而血同型半胱氨酸水平显著低于对照组同时间点(F=6.42，P=0.016)。见表6。

表6 两组基线期和随访期间的疗效评价指标比较

2.4 两组随访至96周时生存情况比较 随访至96周时，共12例受试者死亡。治疗组和对照组的死亡比例分别为3/12和9/12，差异有统计学意义(P=0.047)。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，治疗组患者的生存率86.4%(19/22)显著高于对照组7/16(P=0.048)，见图1。主要死亡原因为心脑血管疾病9例，其中治疗组1例，对照组8例；恶性肿瘤2例，皆为治疗组；感染1例，为对照组。

图1 两组患者Kaplan-Meier生存曲线分析结果

2.5 两组不良事件发生情况比较 随访期间不良事件总发生率为66.0%(33/50)。治疗组不良事件发生率为21.2%(7/33)，包括恶性肿瘤3例，心脑血管疾病2例，心力衰竭1例和低血压1例；对照组不良事件发生率为78.8%(26/33)，包括心脑血管疾病12例，心力衰竭3例，感染3例，动静脉内瘘失去功能3例，上消化道出血2例和低血压1例，其他不良事件2例；对照组不良事件发生率显著高于治疗组(P<0.001)。其中，治疗组心脑血管疾病的发生率为2/7，显著低于对照组的46.2%(12/26，P=0.005)。

3 讨 论

本研究结果显示，应用硫胺素联合叶酸行强化治疗96周后，治疗组行MHD的ESRD患者的MoCA量表评分显著高于对照组，提示该治疗方案可显著改善ESRD相关CI。研究[10,12]结果显示，小鼠硫胺素和叶酸缺乏会诱导其大脑皮层和海马区组织发生氧化应激，导致认知功能损害。这可能是由于硫胺素作为酮醇酶的辅助因子，可充当氧自由基的清除剂，在减少神经系统ROS产生，减轻氧化应激反应中发挥重要作用[10]；或由于叶酸的直接抗氧化效应，其与eNOS相互作用，影响NO辅助因子的生物利用度。同时，叶酸是同型半胱氨酸代谢为甲硫氨酸时的必需物质，可以降低行MHD患者的同型半胱氨酸水平[9]，从而缓解氧化应激反应。此外，本研究结果显示，治疗组患者的生存率显著高于对照组，不良事件发生率显著低于对照组，尤其是心脑血管事件的发生率。本研究为行MHD继发CI的ESRD患者的治疗提供了初步的数据支持。

普通人群中血硫胺素的正常值范围为70～180 nmol/L[13]。然而，行MHD患者血硫胺素水平往往低于普通人群，本研究也得到了相似的结果。笔者分析认为，硫胺素作为一种水溶性维生素，其被机体吸收的能力受尿毒症毒素水平的影响；此外，该物质会被HD所清除，特别是对于接受高通量透析的患者。本研究结果显示，经96周的硫胺素补充后，血中硫胺素水平较基线期升高，但差异无统计学意义，这可能与尿毒症环境导致的硫胺素转运蛋白1和2表达水平下降有关[14]，亦或是因为机体对硫胺的需求量增加，相关结论需进一步研究加以验证。在普通人群中，血叶酸的正常值范围为2.7～17.0 ng/mL[14]。本研究结果显示，行MHD患者血叶酸水平处于正常值范围的低值；补充叶酸96周后，血叶酸水平显著高于基线期，同时高于普通人群的正常范围，这一结果符合本研究团队的预期；此外，随访96周时，患者血同型半胱氨酸水平较基线期显著降低，进一步说明，行MHD患者血叶酸水平的升高可能会促进同型半胱氨酸水平的降低[15]，从而带来心血管获益[16]，改善患者预后。

对于行MHD患者而言，同型半胱氨酸不仅是一种尿毒症毒素，还是氧化应激发生的生物学标志物。多项观察性研究[17-19]结果表明，血同型半胱氨酸水平升高与CI的发生密切相关。此外，既往研究[20]发现，诸多机制均可导致行MHD患者的血同型半胱氨酸水平升高，如B族维生素，特别是硫胺素和叶酸的缺乏。在本研究中，两组患者的血同型半胱氨酸水平在基线期均显著高于正常范围(5～15 μmol/L)，提示行MHD继发CI的ESRD患者存在氧化应激状态[21]。经过96周硫胺素联合叶酸强化治疗后，与基线期相比，血同型半胱氨酸水平有下降趋势，但差异无统计学意义。这提示，硫胺素联合叶酸治疗改善MoCA量表评分的机制并非依赖于血同型半胱氨酸水平的降低。本研究团队已开展一项前瞻性、随机、双盲、安慰剂对照的多中心临床研究，希望借此阐明血同型半胱氨酸在行MHD继发CI的ESRD患者中的作用。

值得一提的是， 本研究团队的前期研究[6]发现，经过3年随访，行MHD继发CI的ESRD患者的生存率较非CI患者显著降低，提示CI是ESRD患者死亡的危险因素；近期的COGNITIVE-HD研究[22]也证实了这一结论。因此，临床亟须寻找治疗或改善行MHD继发CI的有效方法或手段。本研究应用硫胺联合叶酸对行MHD继发CI的ESRD患者进行治疗，随访至96周时发现，治疗组的死亡率显著低于对照组，生存曲线分析亦提示其生存率显著高于对照组；同时，两组患者死亡的主要原因为心脑血管疾病。因此推测，硫胺素联合叶酸的强化治疗不仅可提高患者MoCA量表评分，还可降低行MHD患者心脑血管疾病的发生风险；并且氧化应激可能是行MHD患者发生认知功能损害和心脑血管疾病的共同机制之一[3]。因此，可通过补充维生素B缓解氧化应激反应，尤其是脑组织的氧化应激，或可改善相关患者的认知功能，进一步预防心脑血管疾病的发生、发展。

本研究尚存在一定局限性：①本研究未应用盲法和安慰剂的对照研究设计，这可能导致研究者产生主观偏倚，影响MoCA量表评分的准确性。②本研究样本量较小，可能造成假阴性结果。③本研究只应用MoCA量表评分一种标准来判断患者认知功能的损害程度，主观性较强，且不能涵盖所有认知功能的评估。④治疗组给予了两种药物，尚不能确定是哪一种药物起到了关键作用。未来的研究需要纳入更多的评分标准及影像学检查手段[如阿尔茨海默病评估量表-认知行为(ADAS-Cog)评分[23-24]和MRI功能成像[25]等]，以更精准地判断患者认知功能的改善情况和相关治疗的疗效。

综上，补充硫胺和叶酸可改善行MHD继发CI的ESRD患者的MoCA量表评分，或为其带来生存获益。同时，本研究证实90 mg/d的硫胺素联合30 mg/d的叶酸治疗在行MHD患者中的应用是安全、有效的。本项目组目前正在开展的一项前瞻性、随机、双盲、安慰剂对照的多中心临床研究(中国临床试验注册中心注册号为ChiCTR2000029297)，以期进一步证实本研究的结论。