高通量芯片检测SLE家系成员自身抗体的临床价值探讨*

张 苹，翟建昭，张乃丹，刘在栓，王洋一，唐鸿鹄，武永康，3△

四川大学华西医院：1.实验医学科；2.风湿免疫科；3.门诊部，四川成都 610041

系统性红斑狼疮(SLE)是一种导致多器官损伤的自身免疫性疾病，其特征是机体对自身抗原失耐受、产生自身抗体和免疫复合物，遗传和环境因素的相互作用在其发病中占有很重要的地位[1]。目前SLE的诊断主要依靠临床症状及血清学标志物的检查，由于其临床表现的多样性及血清学标志物检测阳性率的问题，致使SLE的早期诊断困难。遗传因素对SLE致病作用的研究显示，SLE家系患者的直系亲属比健康人群患病概率增加100倍[2]，并且同一家系的患者在易感基因的筛查中显示出了较强的一致性。虽然至今已发现超过200种自身抗体[3]，但由于临床应用的限制及特异度、灵敏度问题，只有约20种自身抗体在临床上使用。抗原芯片作为一种高通量的自身抗体检测方法，其检测通量高(最多可同时检测上千个自身抗体)、所需样本量少，检测灵敏度及精密度是酶联免疫吸附试验的4～8倍[4]，并可根据需求自主组合进行检测，对于家系标本尤其适用。因此，本研究采用抗原芯片对3个SLE家系患者进行120种自身抗体的检测，探讨基于家系的自身抗体表达情况，希望能为SLE诊断提供更加完善、精准的路径。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择本院确诊的7例SLE患者(来自3个SLE家系)作为病例组，根据家系不同，将其分为SLE家系1组(3例)、SLE家系2组(2例)、SLE家系3组(2例)。3个SLE家系均由患病的非双胞胎亲姐妹组成。选择家系1中未诊断为SLE的4名健康者作为对照组。确诊SLE病例均符合美国风湿病学会1997年修订的诊断标准[5]。采集研究对象无抗凝剂的外周血5 mL于真空采血管，2 h内离心，分离血清置于-80 ℃冰箱冻存。

1.2方法 自身抗体检测：采用包被有120种自身抗原的OmicsArrayTM自身抗体检测芯片进行检测，使用Cy3标记的抗人免疫球蛋白(Ig)G抗体检测血清IgG自身抗体水平，在532 nm处检测荧光信号。为了分析自身抗体水平在SLE家系病例中的表达是否高于对照组，并且鉴别自身抗体在不同家系表达的差异，笔者使用自身抗原芯片检测了120个自身抗体，并采用OmicStudio 在线云工具绘制高级热图(https://www.omicstudio.cn)，该工具使用R 3.6.1软件进行分析。

2 结 果

2.1家系图谱结果 SLE家系1中的3例患者基本信息为病例1女、38岁，病例2女、36岁，病例3女、32岁；SLE家系2中的2例患者基本信息为病例4女、55岁，病例5女、43岁；SLE家系3中的2例患者基本信息为病例6女、18岁，病例7女、30岁；对照组中的基本信息为对照1女、20岁，对照2男、14岁，对照3女、13岁，对照4女、74岁。家系图谱见图1～3。

图1 SLE家系图谱1

图2 SLE家系图谱2

图3 SLE家系图谱3

2.2SLE家系与对照组自身抗体检测结果热图比较 由图可见，3个SLE家系病例的自身抗体检测水平总体较对照组上调。见图4。

2.3各SLE家系组与对照组IgG型自身抗体水平结果比较 为了研究不同遗传背景的家系患者在自身免疫性抗体检测中是否具有家族特异性，将SLE家系1组、SLE家系2组、SLE家系3组分别与对照组进行组间差异性分析。结果发现有4个自身抗体水平有差异，分别为抗dsDNA抗体、抗ssDNA抗体、抗染色体DNA抗体、抗胶原Ⅵ抗体。与对照组比较，SLE家系1组中抗dsDNA抗体、抗ssDNA抗体、抗染色体DNA抗体、抗胶原Ⅵ抗体水平差异有统计学意义(P=0.014、0.014、0.004、0.049)；SLE家系2中抗ssDNA抗体水平差异有统计学意义(P=0.026)；SLE家系3组中抗dsDNA抗体、抗ssDNA抗体、抗染色体DNA抗体、抗胶原Ⅵ抗体水平差异有统计学意义(P=0.002、0.001、0.001、0.005)。见表1。

注：抗体反应荧光值与平均值相近的显示为灰色，抗体荧光值高于平均值的，随着抗体荧光值的升高颜色越趋近于黑色，相反越趋近于白色；热图左侧为聚类分析结果，聚为一组的抗原具有相对一致的反应性，热图右侧表示的是芯片包被的120种抗原名称。

2.4各IgG型自身抗体水平结果比较 与对照组比较，SLE家系1、2、3组共有4种自身抗体水平差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，病例组共有8种自身抗体水平差异有统计学意义(P<0.05)。除表1的4种自身抗体外，还检测出了抗硫酸软骨素C抗体、抗GP210抗体、抗U1-snRNP 68/70抗体、抗U1-snRNP C抗体。见表1、2。

表1 各SLE家系组与对照组IgG型自身抗体水平结果比较

表2 病例组与对照组IgG型自身抗体水平结果比较[ M(P25,P75)]

组别n抗硫酸软骨素C抗体抗GP210抗体抗U1-snRNP 68/70抗体抗U1-snRNP C抗体病例组75.82(4.90,9.25)5.68(3.69,7.33)28.38(24.08,43.20)33.72(26.48,197.34)对照组 41.69(0.58,2.74)1.67(0.58,3.33)12.92(7.63,20.72)14.75(9.00,24.87)P0.0250.0330.0380.038

3 讨 论

SLE是一种由遗传因素作用且临床异质性明显的自身免疫性疾病，其血清学特征是产生针对各种细胞内和细胞外成分的循环自身抗体，包括蛋白质、核酸、核蛋白、磷脂、糖蛋白和糖脂等[3]。SLE具有家族聚集性，家族患病史是其发病的危险因素，不同种族SLE家系患者的患病率不同[6]。由于同一家系遗传背景相同，通过组合多种自身抗体来验证血清学自身抗体在表达上是否存在家系内的一致性，家系间的异质性，寻找SLE诊断模型，有助于SLE的精准诊断。本研究使用高通量抗原检测芯片，首先在遗传背景不同的家系标本中进行检测，共筛选出4种自身抗体，包括抗dsDNA抗体、抗ssDNA抗体、抗染色体DNA抗体、抗胶原Ⅵ抗体，结果显示不同家系患者与对照组比较，显示出自身抗体的差异性，表明不同家系之间可能存在异质性。考虑到家系样本量较少，笔者又将3个家系病例汇为一组作为病例组与对照组进行比较。结果表明，除了之前鉴定出的4种自身抗体外，还鉴定出了抗硫酸软骨素C抗体、抗GP210抗体、抗U1-snRNP 68/70抗体、抗U1-snRNP C抗体等水平有差异的抗体。结果显示，随着样本量的增加，可以发现更多SLE相关自身抗体。

SLE主要病理表现是产生大量自身抗体，如抗核抗体、抗dsDNA抗体、抗Sm抗体、抗核小体抗体、抗U1-RNP抗体、抗核糖体p抗体等。在SLE诊断中，主要检测指标有抗dsDNA抗体，抗Sm抗体、抗磷脂抗体等。本研究筛查出了SLE诊断的相关抗体，如抗dsDNA抗体，也发现了一些与疾病致病可能相关而非常规检测的抗体。

抗dsDNA抗体作为SLE诊断的经典指标，已被纳入SLE分类标准[7]及疾病活动指数指南[8]，70%～80%的SLE患者可检测到抗dsDNA抗体，其中45%～50%的SLE患者表现为抗体高滴度[9]，其滴度与疾病活动度及器官损伤有关。抗dsDNA抗体可识别多种自身抗原，从而触发细胞凋亡、炎性反应和组织纤维化[10]。ssDNA由dsDNA通过解链形成，抗ssDNA抗体在生物化学和抗原特性上与抗dsDNA具有一致性[11]。关于SLE患者在抗DNA抗体检测的研究中显示，抗ssDNA抗体对SLE的诊断灵敏度接近100%，与其他自身抗体联合诊断，特异度可达到98%，因此曾被报道为检测SLE灵敏度很高的指标[12]。由于抗dsDNA抗体诊断SLE特异度高，被用于SLE诊断的常规检测指标，但其灵敏度较低，若联合使用抗ssDNA抗体可增加SLE患者的检出率。

本研究中抗胶原Ⅵ抗体、抗硫酸软骨素C抗体、抗GP210抗体的检测结果显示了SLE家系的异质性。胶原Ⅵ为胶原中的一种，几乎存在于所有组织的细胞外基质中，与皮肤、肾脏、神经、血管和肌肉中基底膜密切相关，也分布于胶原纤维周围，保护软骨细胞免受压力，同时胶原Ⅵ也可抑制细胞凋亡和氧化损伤，影响代谢，促进细胞生长[13]。研究显示，在SLE患者中抗胶原Ⅳ抗体、抗胶原Ⅴ抗体与免疫反应有关，未发现抗胶原Ⅵ抗体与SLE的关系[14-15]。硫酸软骨素是天然存在的糖胺聚糖，也是聚蛋白聚糖的一部分，被认为是关节软骨的重要组成部分[16]，硫酸软骨素根据不同的硫化模式，主要分为4种类型，硫酸软骨素C为其中的一种[17]，主要应用于关节炎的治疗。抗GP210抗体是一种针对自身核膜成分的自身抗体，是定位于核孔的复合物，对原发性胆汁性肝硬化的诊断有高度特异性，有研究表明，抗GP210抗体的存在与关节炎的患病率有关[18]。上述3个指标与关节、软骨损伤反应相关，而SLE是一种累及多器官损伤的疾病，因此，抗体阳性提示患者可能有潜在的关节损伤，患者应多注意关节疾病，定期复查，尽早干预。

研究表明，SLE患者会对染色体DNA起较强生物免疫反应，细胞凋亡率的增加会导致酶修饰核酸的释放，这些修饰过的核酸被免疫效应细胞识别为外源抗原，从而触发免疫应答[19]。抗U1-snRNP自身抗体在30%～40%的SLE患者和几乎所有混合性结缔组织病的患者中可检测到，是混合性结缔组织病良好的预测因子，但在SLE诊断中的特异度不高[20]。

由于自身抗体特异度、灵敏度的差异，患者遗传背景、潜在患病因素的不同，不同家系之间的自身抗体谱不同，导致检测工作量大。因此，笔者利用高通量抗原芯片检测技术筛查出了与SLE相关性较好的指标，并且随着纳入样本量的增加，筛查指标也随之增多，显示出了抗原芯片在自身抗体筛选方面的应用潜力。将筛选出的自身抗体作为SLE的联合诊断指标，可提高疾病诊断的特异度和灵敏度。同时，针对相同遗传背景的患者组合自身抗体进行检测，可对家系内未发病人群的疾病预测提供较好的支持。本研究纳入病例数较少，因此还需大样本的临床试验进行验证。