截短侧耳素衍生物ZYY-12h对MRSA菌株的抑菌作用及作用机制研究

孙宇豪 陈恬 林皓楠 邱诗越 范维 修思琴

(成都医学院基础医学院，成都 610500)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作为一种常见的人类共生细菌，大约三分之一人的皮肤和鼻孔黏膜上都有这种革兰阳性细菌[1-2]。当人体免疫力下降时，它能够侵袭局部组织引起肺炎、骨髓炎和心内膜炎，甚至进入血管造成感染性休克[3]。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus, MRSA)是由金黄色葡萄球菌通过基因水平转移和自然选择而来的一种对β-内酰胺类抗生素具有多重耐药性的菌株。自从MRSA菌株在1961年被Jevons首次发现以来，其在全球范围内的感染率呈上升趋势[4]，所引起的疾病目前和乙型肝炎、艾滋病一起被列为全球3大难治的感染性疾病[5-6]。

临床上目前用于治疗MRSA感染的药物主要为万古霉素，它可以阻断肽聚糖合成，造成细胞壁缺陷，使菌体裂解死亡[7]。但近年来由于万古霉素在抗感染治疗中的大量应用，MRSA对其的敏感性也逐年下降[8],并且发现了耐万古霉素的金黄色葡萄球菌(vancomycinresistanceStaphylococcus aureus，VRSA)[9]。因此，新型抗MRSA感染药物的研究与开发是当前抗生素药物研究的重点。

截短侧耳素衍生物ZYY-12h由西华大学张园园教授合成[10]，其结构如图1所示。预实验发现该化合物对MRSA菌株有较明显的抑菌作用，本实验欲通过绘制杀菌曲线、测定细菌细胞膜通透性、细菌可溶性蛋白含量和观察细菌外部形态结构进一步研究其抑菌作用及作用机制，为合成更有效的抗菌化合物提供实验基础。

1 材料

1.1 实验菌株

MRSA菌株ATCC33591和ATCC43300购自美国典型菌种保藏中心，于-80℃保存。

1.2 药物和试剂

截短侧耳素衍生物ZYY-12h和截短侧耳素(由西华大学张园园教授提供)；万古霉素盐酸盐(上海生工生物工程股份有限公司)；MH琼脂培养基和MH肉汤培养基(杭州百思生物技术有限公司)；考马斯亮蓝R-250(德国Biofroxx公司)；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)和彩色预染蛋白分子量标准(10～170 kD)(上海碧云天生物技术有限公司)。

2 方法

2.1 细菌的药物敏感性实验

2.1.1 抑菌圈测试(DIZ)

向50℃左右的液态固体培养基中加入适量0.5麦氏比浊浓度的MRSA菌株ATCC33591和ATCC43300菌液使培养基菌浓度为107CFU/mL，混匀后趁培养基未凝固倒平板。固体培养基冷却凝固后用打孔器在中心打孔加入20 μL化合物ZYY-12h溶液作为实验组，设立3组复孔，以万古霉素和截短侧耳素作为阳性对照，含1% DMSO的培养基作为阴性对照，37℃培养18～20 h后，用游标卡尺测定各组的抑菌圈直径[11]。

2.1.2 最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC)

根据美国临床实验室标准协会(CLSI)标准[12]采用微量肉汤稀释法测定截短侧耳素衍生物ZYY-12h对MRSA菌株ATCC33591和ATCC43300的最小抑菌浓度(MIC)，从128 μg/mL浓度开始倍比稀释化合物，设立3个复孔，以万古霉素和截短侧耳素作为阳性对照，1%DMSO作为阴性对照，每一孔加入100 μL的105～106CFU/mL的菌液，轻微振荡后放入37℃培养箱中培养18～20 h后，肉眼观察96孔板，未见浑浊的最低药物浓度即为最小抑菌浓度(MIC)。再从上述MIC孔及其前4孔中取出50 μL培养液涂布于MH平板上，37℃继续培养18～20 h后，培养皿中无细菌生长的ZYY-12h最低浓度即为最低杀菌浓度(MBC)。

2.2 时间-杀菌曲线

在MH肉汤培养基中分别加入不同剂量的截短侧耳素衍生物ZYY-12h使其终浓度分别为0、0.5×MIC、1×MIC、2×MIC和4×MIC，再加入相应对数生长期的MRSA菌株ATCC33591菌液(106～107CFU/mL)，放入37℃培养箱中，在0、2、4、6、12和24 h分别取10 μL培养液10×倍比稀释后接种于MH平板，37℃培养24 h后进行菌落计数，以活菌数的对数为纵坐标，时间为横坐标，绘制时间-杀菌曲线。

2.3 细胞膜通透性测试

在MH肉汤培养基中接种对数生长期的MRSA菌株ATCC33591菌液，将细菌浓度调节为107～108CFU/mL，分别加入截短侧耳素衍生物ZYY-12h，使ZYY-12h的浓度分别为0、1×MIC、2×MIC、4×MIC和8×MIC，在37℃恒温摇床中连续培养。分别在1、2、4和6 h取各组培养液1 mL，4000 r/min离心10 min，取上清液用微量分光光度计测定A260[13]。

2.4 MRSA菌可溶性蛋白含量测定

在MH肉汤培养基中加入对数生长期的MRSA菌株ATCC33591菌液，将细菌浓度调节为107～108CFU/mL，分别加入截短侧耳素衍生物ZYY-12h，使ZYY-12h的浓度分别为0、1×MIC、2×MIC和4×MIC，放入37℃恒温摇床连续培养16h后，离心机4000 r/min离心10 min弃上清液，用PBS稀释沉淀至A600为0.6，取等量各组菌悬液离心收集沉淀混悬于40 μL无菌水中，以1:4体积比加入上样缓冲液，吹打混匀后沸水浴煮沸10 min，最后4000 r/min离心10 min取上清液进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色[13-14]。

2.5 细菌形态观察

在MH肉汤培养基中接种对数生长期的MRSA菌株ATCC33591菌液，将细菌浓度调节为107～108CFU/mL，分别加入截短侧耳素衍生物ZYY-12h，使化合物的浓度分别为0、2×MIC和4×MIC，放入37℃恒温摇床连续培养20h后收集菌体，依次用戊二醛和梯度浓度乙醇固定脱水后送到四川大学分析测试中心用扫描电子显微镜(SEM)观察细菌的形态结构[15]。

2.6 统计学分析

采用SPSS21.0软件分析数据。本研究中涉及到的定量资料以(x_±s)形式描述，用方差分析的方法比较组间差异，以P<0.05则差异有统计学意义。

3 结果

3.1 细菌的药物敏感性实验

药敏试验结果如表1所示， 截短侧耳素衍生物ZYY-12h对ATCC43300和ATCC33591两种MRSA标准菌株的抑菌圈直径(DIZ)分别为(24.9±1.33) mm和(24.9±0.83) mm，最小抑菌浓度(MIC)均为0.125 mg/mL，与对照组相比，MRSA菌株对ZYY-12h的敏感性明显大于其母核截短侧耳素，且ZYY-12h略优于目前临床针对MRSA感染最常用抗生素万古霉素。ZYY-12的最小杀菌浓度(MBC)为0.5 mg/mL，说明在较高浓度下ZYY-12h具有杀菌作用。

表1 MRSA菌株的抗生素敏感性实验结果Tab.1 Antibiotic susceptibility test results of MRSA strain

3.2 时间-杀菌曲线

时间-杀菌曲线结果如图2所示，正常生长曲线对照组的细菌在2 h后进入对数生长期快速增殖，10 h后增殖速度减慢但仍在缓慢增殖。在1×MIC浓度水平，ZYY-12h和截短侧耳素与对照组相比在0～10 h内均有一定的抑菌作用，且ZYY-12h组的抑菌作用更明显，但在两组在24 h后均未表现出明显的杀菌效果。在4×MIC浓度水平，ZYY-12h和截短侧耳素均有明显的抑菌作用，在10～24 h内使细菌数量急剧下降并且在24 h后将细菌全部杀死。

3.3 细胞膜通透性测试

细胞膜通透性测试结果如图3所示，未用截短侧耳素衍生物ZYY-12h处理的阴性对照组上清液6 h内A260未出现明显变化，始终小于0.08；与对照组相比，除了1×MIC组，其他经ZYY-12h处理后的各实验组上清液A260都有明显的升高，且随时间的增加而增加(P<0.05)。在相同的时间点上，ZYY-12h的浓度越高上清液在260 nm处的吸光度值也越高(P<0.05)。综上MRSA菌株的细胞膜通透性与新截短侧耳素衍生物ZYY-12h呈时间-效应关系和剂量依赖关系。

3.4 MRSA菌可溶性蛋白测试结果

可溶性蛋白测试结果见图4，与未用截短侧耳素衍生物ZYY-12h处理过的对照组相比，用ZYY-12h处理过的3个实验组泳道大部分条带颜色较浅，尤其是分子量大小在70和25 kD附近的两个条带几乎消失；而55和15 kD附近的两个条带与对照组相比略有加深。同时随着ZYY-12h的浓度增加，条带颜色越浅，当ZYY-12h浓度达到4×MIC时，几乎观察不到被考马斯亮蓝染色的可溶性蛋白。

3.5 细菌形态观察结果

扫描电子显微镜观察结果如图5所示，在10,000倍放大下可以观察到对照组细菌外观饱满、形态规则、表面光滑，折光性好；经过不同浓度ZYY-12h处理后，实验组与阴性对照组相比，虽形态结构大致完整，但细菌表面粗糙、皱缩，折光性下降，菌体之间出现黏连聚集；且4×MIC组细菌表面出现明显的条索状黏连隆起，菌体之间的黏连更加明显。

4 讨论

近年来由于抗生素的大量使用，细菌的耐药问题越来越引起人们的重视，其中MRSA菌株引起的感染最为常见[16]。甲氧西林耐药基因(mecA)调节产生的特殊青霉素结合蛋白PBP2a是MRSA菌株产生耐药性的主要原因，由于β-内酰胺类抗生素与其亲和力很低，所以无法有效抑制MRSA菌株的生长[17]。截短侧耳素是1951年由哥伦比亚科学家Kavanagh等[18]从真菌担子菌纲侧耳属Pleurotus mutilis和Pleurotus passeckerianus菌中分离提取所得，骨架由一个八元环、一个六元环和一个五元环组成，由于其能够和细菌核糖体肽酰基转移酶中心(PTC)发生作用，抑制菌体蛋白质的合成，从而抑制细菌的增殖[19]。目前应用的截短侧耳素衍生物主要有泰妙菌素(tiamulin)、沃尼妙林(valnemulin)和瑞塔莫林(retapamulin)。由于目前截短侧耳素及其衍生物的生物利用度较低，在人体内无法发挥有效抑菌作用，所以只有瑞塔莫林用于临床抗感染，主要针对化脓性皮肤病[20]。但是截短侧耳素具有良好的抗菌活性和特殊的抑菌机制，且耐药缓慢，所以设计合成截短侧耳素的新衍生物对解决当前的细菌耐药问题有十分重要的意义。

本研究测定了截短侧耳素衍生物ZYY-12h的抑菌活性并对其抑菌机制做了初步探究。药敏试验测得ZYY-12h对MRSA菌株的最小抑菌浓度(MIC)为0.125 mg/mL，最小杀菌浓度(MBC)为0.5 mg/mL，比临床抗MRSA感染最常用的万古霉素更加敏感。在此基础上测定了时间-杀菌曲线，能够动态地观察不同浓度ZYY-12h在不同时间抑菌活性的变化[21]。ZYY-12h对MRSA菌株的抑制主要表现在细菌的对数生长期，在较低浓度(1×MIC)下短时间内可抑制细菌快速增殖但是10 h后抑菌作用逐渐减弱；较高浓度(4×MIC)下则直接表现为杀菌作用，24 h内可将细菌基本杀死，说明其抑菌机制可能是抑制某些细菌增殖所必须材料的合成或者组装，从而使细菌无法正常增殖。蛋白质是维持细菌生命活动的重要物质，一旦蛋白质的生成受到抑制，细菌就无法进行正常的生命活动[22]。通过SDS-PAGE电泳发现经ZYY-12h处理后的MRSA细菌中可溶性蛋白含量明显减少，分子量大小接近70和25 kD蛋白，提示ZYY-12h可能与其母核截短侧耳素相似，能够与细菌核糖体50S亚基结合，抑制细菌蛋白质的合成。细菌的细胞膜是细菌极其重要的结构之一，承担着物质转运、呼吸和分泌、生物合成以及参与细菌分裂等重要生理功能[23]。当细菌细胞膜通透性改变时，胞内DNA、RNA等大分子物质会泄漏到胞外，所以波长260 nm处上清液吸光度值被认为是反应细胞膜通透性改变的一项重要指标。张斌等[24]就通过测定细菌悬液离心的上清液A260发现地榆水提液能够使MRSA菌株细菌细胞膜的通透性改变从而抑制细菌生长。

值得注意的是本研究中经ZYY-12h处理后的MRSA细菌上清液A260有明显升高，提示有大量大分子物质从细菌内渗出， 说明改变MRSA菌株细胞膜的通透性使细菌无法维持正常的生理活动是ZYY-12h的抑菌机制之一。除此之外，本研究中经过ZYY-12h作用后的MRSA细菌与正常MRSA细菌相比菌体表面更加粗糙且出现明显皱缩，菌体之间有黏连聚集现象，提示ZYY-12h能够改变MRSA菌株的外部形态结构，但未到达杀灭的程度。

综上，ZYY-12h作为截短侧耳素的衍生物其抗菌机制与其母核有相似之处，都能够抑制细菌蛋白质的合成，但细菌细胞膜通透性和外部结构的改变均提示ZYY-12h还能够使MRSA菌株细胞膜结构和功能改变，这可能是由于某些MRSA细菌细胞膜蛋白合成被抑制，使细菌细胞膜上的通道蛋白和载体蛋白等的转运功能受到影响，或者是细菌细胞膜上的结构蛋白减少，最终导致细菌内外物质交换失衡；也有可能是ZYY-12h直接作用于细菌表面的某些靶点，破坏菌体细胞膜结构进而使其通透性改变。但其具体机制还需要进一步的实验研究。

细菌耐药是临床上一大难题，目前大部分抗生素都被发现有相对应的耐药菌株，而新截短侧耳素衍生物ZYY-12h作为一个半合成新抗生素，对MRSA具有良好的抑菌活性，有较好的开发潜力和应用前景。本研究旨在为以后合成更有效的截短侧耳素衍生物提供理论基础和科学依据。