细菌ClpP蛋白酶功能及其抗菌药物靶点的研究进展

颜骊颖 张亚培 董世雷,*

(1 浙江中医药大学医学技术学院，杭州 310053；2 浙江医院医学检验科，杭州 310013)

能量依赖型蛋白酶或蛋白酶复合物是细胞中最常见的蛋白降解系统，在其对蛋白降解的过程中，通常依靠AAA+超家族(ATPases associated with various cellular activities)中的ATP酶(ATPase)水解ATP提供能量[1]。在AAA+超家族蛋白中至少存在10种不同类型的ATP酶(ClpA，ClpB，ClpC，ClpD，ClpE，ClpL，ClpM，ClpN，ClpX和ClpY)[2-3]，它们可被分为两类：一类分子量较大，含有两个典型ATP结合结构域，如ClpA，ClpB，ClpC，ClpD，ClpE和ClpL；另一类分子量较小，仅含一个ATP结合结构域，如ClpM，ClpN，ClpX和ClpY。到目前为止，发现ClpA，ClpC，ClpE和ClpX可以与ClpP蛋白酶结合形成蛋白酶复合物ClpAP，ClpCP，ClpEP，ClpXP或ClpAPX，而ClpY(又称HslU)可与ClpQ(又称HslV)蛋白酶结合形成蛋白酶复合物ClpYQ(HslUV)。在ATP酶水解ATP提供能量的前提下，蛋白较容易地被ClpP或ClpQ降解。ClpP和ClpQ均属于Ntn水解酶超家族(N-terminal nucleophile hydrolase superfamily)，该超家族蛋白通常借助其N-末端的亲核氨基酸自催化而活化，即N-末端氨基充当质子受体激活位于Ser或Thr残基上的亲核性羟基或Cys残基上的亲核性巯基，继而对底物进行亲核攻击，使其水解。

细菌AAA+蛋白酶在不同细菌中的分布略有差异，如ClpAP，ClpXP和ClpYQ多分布于革兰阴性菌中[4-6]，而ClpCP和ClpEP多分布于革兰阳性菌中[7-10]，如枯草芽胞杆菌、变异链球菌和金黄色葡萄球菌等。本文将主要讨论细菌ClpP的结构及分子功能、在不同细菌中的作用以及基于细菌ClpP的抗菌药物研发方面的研究进展。

1 细菌ClpP的结构及分子功能

细胞内蛋白质的水解与细胞功能密切相关。在细胞中，即使无基因突变和蛋白翻译错误，也有超过三分之一的新合成的蛋白质不能正确折叠，其中被正确折叠且有正常功能的蛋白也极易因不利环境因素如热休克、渗透压、氧化应激和氧自由基等而受损[11]。当这些折叠不完全的、受损的蛋白积累到一定程度后，将会导致细胞死亡，故蛋白质的降解与蛋白质的合成同等重要，它们在细胞生命周期中发挥着至关重要的作用。在蛋白质降解过程中，AAA+超家族中的ATP酶可通过水解ATP提供水解蛋白过程中所需的能量。ClpP是一种丝氨酸蛋白酶，其活性位点位于其桶状蛋白水解室内，当它与AAA+超家族ATP酶或Clp/Hsp100分子伴侣(Clp-ATPase)结合时，可以水解多种类型的蛋白质，维持细胞内新陈代谢动态平衡[12]。

细菌AAA+ ATPase-ClpP蛋白酶复合物的结构与真核生物26S蛋白酶体相似，由ATP酶(或分子伴侣)和ClpP蛋白酶组合而成，其中ATP酶(如ClpA、ClpC、ClpE和ClpX等)可组成同源多聚体，负责蛋白底物的识别和解折叠，决定ClpP蛋白酶的底物特异性，并将底物转运至蛋白酶催化室中降解，在催化室中，ClpP可利用内部活性位点将底物降解成多肽小片段。在AAA+ATPase-ClpP蛋白酶复合物中，ATP酶可自行装配成同源六聚体，ClpP可寡聚体化后形成内部含有14个催化活性位点的同源七聚体，共同组成桶状蛋白酶复合物ClpAP、ClpCP、ClpEP、ClpXP或ClpAPX。底物蛋白经降解，将被水解为5～10个氨基酸残基组成的短肽[12]。

ClpP可相互聚集形成由两个纵向排列的同源七聚体组成的十四聚体型圆柱体，七聚体环的轴向孔隙是水解室的入口，形成蛋白质水解室[13]，如图1所示，Clp分子伴侣可以结合在ClpP十四聚体型圆柱体的两端，在分子伴侣捕获到折叠不完全的、受损的目标蛋白后，在水解ATP提供能量的前提下将底物蛋白去折叠，然后通过七聚体环的轴向孔隙将去折叠的底物蛋白转移至ClpP水解室内，然后将去折叠的底物蛋白水解为小肽段，接着ClpP蛋白分子构象改变，打开侧边赤道面孔道(equatorial side pores)释放水解产物。

研究表明，缺失N-端前段的10～17个氨基酸后，大肠埃希菌ClpP能够快速降解去折叠的大分子底物，该降解不依赖于分子伴侣的辅助[15]，提示ClpP轴向孔的开放与ClpP的N-端结构域有关。因此，没有ATP酶时，ClpP的N-端区域必须维持关闭的状态，防止蛋白底物进入ClpP的水解室。结合分子伴侣后，进入ClpP水解室的蛋白分子主要由分子伴侣决定，ClpX含有3个重要结构域，依次为：参与底物识别的家族特异性N-端功能结构域、AAA+功能结构域和C-端功能结构域[16]。分子伴侣能诱导ClpP N-端结构域的构象改变，有利于大分子去折叠蛋白底物的转移。

据文献报道，ClpP具有多个亚型，在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)中，同一操纵子中同时编码ClpP1和ClpP2两个亚型的蛋白，这两种蛋白异构体可形成一个由ClpP1和/或ClpP2七聚体环组成的十四聚体型蛋白酶复合物[17]。目前，在钩端螺旋体、铜绿假单胞菌和单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)中也存在两种ClpP亚型(ClpP1和ClpP2)，而在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中仅发现一种ClpP，故ClpP在不同细菌中可能发挥着不同的作用[17-18]。

2 ClpP在细菌中的重要作用

ClpP及其相应蛋白酶复合物主要功能是清除或降解细菌胞内合成不当、受损伤、变性聚集或无用的蛋白，从而维持细菌正常代谢和压力刺激下胞内蛋白质的动态平衡[19]，ClpP蛋白底物种类较多，目前研究结果显示，除参与蛋白质代谢外，ClpP还与细菌药物敏感性和毒力调控有关。

2.1 ClpP在细菌蛋白质代谢中的作用

随着外界环境的改变，如温度变化、氧化损伤和营养限制等，细菌通常会为适应环境而做出一定的生理和生化改变，这种应激反应处置能力对其生存是至关重要的，细菌胞内蛋白质降解被广泛用于调节生理过程及清除异常或受损蛋白，在这些调节过程中ClpP发挥着重要作用。当蛋白质合成过程被意外中断时，蛋白C末端将会被标记上一个含有11个氨基酸的SsrA标签(大肠埃希菌SsrA序列为AANDENYALAA)，随后被ClpXP或ClpAP识别并降解，防止变性蛋白累积带来的不利影响[8,20]。在正常生长条件下，大多数细菌中的ClpP蛋白处于低水平，当环境改变后，表达水平将会明显上调。在应激条件下，DNA修复蛋白RecN处于高水平，受ClpXP调控后，可避免其对细菌的不良影响，直至细胞回到无压力状态[21-22]。此外，大肠埃希菌中一种重要的应激反应调控因子σS，也受到ClpXP所调控[23]。单核细胞增多性李斯特菌可编码两种不同亚型ClpP，分别为ClpP1和ClpP2[24]，当李斯特菌处于热应激(heat stress)条件时，clpP1和clpP2基因表达水平明显上调[25]，提示ClpP1、ClpP2在单核细胞增生性李斯特菌蛋白质降解中起着重要作用。Zhang等[26]构建了肺炎链球菌的clpP突变株，采用双向电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对其蛋白质表达水平变化进行了研究，发现clpP基因缺失后，肺炎链球菌胞内与一般应激反应、核苷酸代谢、能量代谢和蛋白质代谢有关的蛋白质的表达水平发生了明显变化。

2.2 ClpP在细菌耐药性中的作用

研究表明，clpP基因突变能使细菌细胞壁增厚，增强对溶酶体降解的抵抗力，使细菌对抗生素的敏感性降低。Mellergaard等[27]从持续接受达托霉素治疗的患者体内分离了5株MRSA(methicillin resistantStaphylococcus aureus)，对其进行序列分析后发现，在治疗过程中金黄色葡萄球菌rpoB和clpP等基因发生了突变，从而导致菌株对达托霉素产生耐受。在变异链球菌(Streptococcus mutans)中，Tian等[28]发现ΔclpP突变株中MazE和RelB蛋白表达量明显增多，该研究结果提示ClpP蛋白可通过水解调控MazE和RelB蛋白，增强变异链球菌在抗生素压力下持留菌/生物被膜的形成能力。Zheng等[19]研究发现粪肠球菌在高浓度利奈唑类或米诺环素暴露96h后，clpP基因缺失突变株数量明显减少，提示ClpP也参与了粪肠球菌的抗生素耐受。上述研究结果显示ClpP蛋白可在细菌耐药中发挥一定的作用。

2.3 ClpP在细菌毒力调控中的作用

ClpP在致病菌毒性基因调控和对宿主细胞致病性方面也发挥着重要作用。Frees等[29]发现，在小鼠皮肤脓肿模型中，与野生株相比，金黄色葡萄球菌ΔclpP突变体毒力明显下降，该研究结果证实ClpP对金黄色葡萄球菌毒力的影响是通过调控毒力因子来实现的，而不是通过提高压力耐受水平实现。Li等[30]研究表明ClpP蛋白酶在嗜肺军团菌毒力调控方面也发挥重要作用。Dickeya dadantiiClpXP可以调节III型分泌系统，维持该菌毒力[31]。铜绿假单胞菌ClpXP可以正向调节藻朊酸盐(alginate)的过表达以及黏液转换(mucoid conversion)，表明ClpP与铜绿假单胞菌的感染有关[32]。Kwon等[33]研究发现肺炎链球菌ΔclpP突变株不能侵入肺部，在小鼠模型中丧失了在鼻咽中的定植能力，且在小鼠巨噬细胞中的存活率降低，该研究结果表明ClpP可以调节毒性基因表达、抵抗宿主攻击。鼠伤寒沙门菌ClpP对σS的产生及细菌毒性也有重要影响[34]。单核细胞增多性李斯特菌ClpP在细胞黏附、入侵及胞内寄生和毒力中发挥重要作用，且参与感染过程中的细胞内快速适应性反应[35-36]。小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)Ail蛋白可赋予该菌体外黏附细胞、入侵细胞、抵抗血清攻击的能力，而该菌ClpP能够调节ail基因的表达，间接影响该菌毒力[37]。Mtb具有复杂的应急调控机制，能够在各种高压力环境中生存下来并保持对宿主的致病性。Mtb的ClpP1、ClpP2蛋白酶复合物是Mtb所必需的，在感染期间清除受损蛋白方面也发挥了重要而不可替代的作用，被认为是最有潜力的抗Mtb治疗药物靶点[38-39]。总之，ClpP蛋白酶与多种细菌致病机理相关，是新药物研发的理想靶标之一。

3 基于病原体ClpP的药物研究

目前，多重耐药菌对人类健康带来的威胁越来越大，寻找新型抗菌药物迫在眉睫。ADEP(acyldepsipeptide，酰基缩肽)是由夏威夷链霉菌(Streptomyces hawaiiensis)产生的一种天然化合物，是一类酰基二肽类抗生素[40]，ADEP可激活ClpP蛋白酶，致使其蛋白水解功能紊乱，从而导致细菌死亡，研究表明，ADEP对PRSP(penicillin resistantStreptococcus pneumoniae)、MRSA和VRE(vancomycin-resistantEnterococcus)等临床多重耐药菌均表现出较好的杀菌活性[41-42]。ADEP1(又称factor A)具有多种同系物，其中常见的6种同系物结构如图2所示。ADEP通过竞争并取代AAA+ ATPase ClpX与ClpP结合，导致ClpP蛋白降解功能失控，从而杀灭病原体，Conlon等[43]研究发现当ADEP4与利福平或利奈唑胺联合使用时，可有效清除持留菌，而在小鼠中，ADEP4与利福平联合使用可以根除金黄色葡萄球菌慢性生物被膜感染。早年研究结果显示ADEP1和ADEP2往往仅对革兰阳性菌具有一定抗菌活性，而对大多革兰阴性菌不敏感，由于其溶解性差、系统清除快以及药物结构不稳定性，致使该药物在小鼠模型中抑菌效果不佳[44]。因ADEP类化合物对革兰阴性菌疗效欠佳，有研究人员对其大环核心残基和N-酰基侧链进行了进一步优化，发现了一种新的ADEP衍生物(ADEP-26)，该衍生物不仅对金黄色葡萄球菌和粪肠球菌等革兰阳性菌显示出较强的活性，而且对淋病奈瑟球菌和脑膜炎奈瑟球菌也有很强的抑制作用[45]。有研究人员试图开发具有抗革兰阴性菌活性的非ADEP类ClpP靶向化合物，并将其称为ACPs(activators of self-compartmentalizing proteases)，这些ACPs以类似于ADEP的方式结合和激活ClpP，能有效地杀灭革兰阴性菌[46]。

除ADEP外，以ClpP为靶点的药物还有β-内酯(β-lactones)类小分子化合物，该类化合物可降低金黄色葡萄球菌毒性，体外实验结果显示，β-内酯还能在ClpP2丝氨酸活性位点处形成共价结合物致使Mtb的ClpP1P2肽酶复合物失活，从而影响Mtb毒力。在恶性疟原虫中，β-内酯也显示出了良好的ClpP抑制作用，实验表明，β-内酯处理显著抑制了无性期寄生虫的体外生长，经β-内酯处理的寄生虫在裂殖体晚期表现出发育停滞现象[47]。尽管它在体外试验中获得了理想杀菌或寄生虫效果，但是由于该类化合物的水溶解能力差，血浆稳定性低，限制了它们的临床应用。此外，Hackl等[48]研究发现，在ClpP蛋白酶抑制实验中，苯基酯(phenyl esters)类化合物的效价大大超过了β-内酯，并在金黄色葡萄球菌中显示出独特的靶向选择性；然而，β-内酯仍然是迄今为止发现的唯一的ClpP特异性抑制剂。

Griffith等[49]采用靶向合成手段获得了一类新型ClpP激活剂脲缩酚肽(ureadepsipeptides)，该类化合物用苯基脲(phenyl urea)取代了缩酚肽(depsipeptide)，具有较高的代谢稳定性。该研究证明脲缩酚肽是金黄色葡萄球菌ClpP的有效激活剂，对化脓链球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌甚至金黄色葡萄球菌生物膜等都具有良好的杀菌活性。

此外，硼替佐米作为一种已知的26S蛋白酶体抑制剂，也可抑制ClpP1P2蛋白酶复合物的活性[50]，但由于其成本高，药代动力学差，半衰期短等，限制了该药物在临床中的应用。值得一提的是，人类线粒体ClpP在人类非传染性疾病中发挥了重要作用[51-52]，因其氨基酸序列与细菌、寄生虫等的ClpP具有一定同源性，其结构也十分相似[53]，这也限制了基于病原微生物ClpP的药物的临床应用。

4 小结与展望

综上所述，ClpP与病原体胞内蛋白质降解和细菌毒力密切相关。目前，与革兰阳性菌相比，ClpP在革兰阴性菌中的研究相对较少，对人类ClpP的生理功能和作用机制的研究还处于早期阶段。本文对几种调节细菌ClpP活性的小分子化合物进行了综述，然而这些化合物还未在人类线粒体ClpP中进行详细的研究，考虑到ClpP蛋白酶的序列保守性，目前仍不能排除针对细菌ClpP的化合物也对人ClpP活性产生影响。因此，在研究细菌ClpP相关靶点药物时，必须考虑这些化合物会不会对人体产生影响。目前，虽然国内外有多个针对ClpP的药物开发计划，但还没有药物进入临床应用阶段。Clp ATPase-ClpP蛋白酶复合物中复杂的蛋白质-蛋白质相互作用，构成了一个特别适合药物开发的系统。ADEP和ACP类化合物通过阻止Clp ATP酶与ClpP蛋白酶之间的结合发挥抗菌作用，但同时也导致了ClpP蛋白酶激活而致使细胞死亡，在基于ClpP蛋白酶的药理研究上，依然任重而道远。