水培条件下氮磷钾对红椿幼苗生理指标的影响*

罗婷 ，杨文忠，张珊珊

(1.云南省林业和草原科学院，云南 昆明 650201；2.云南省森林植物培育与开发利用重点实验室/国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育重点实验室，云南 昆明650201)

合理施肥不仅可以提高肥料利用效率、保护生态环境、协调土壤养分，还对增强植物的抗逆性有重要的作用[1-3]。通常我们研究植物生命活动与外界环境相互关系时，主要是通过植物体内物质和能量的调控与代谢过程来实现的，大多数选用与植物保护酶系统、膜脂过氧化作用、渗透调节机制相关的可溶性蛋白、丙二醛、过氧化物酶和过氧化氢酶等生理生化指标来进行研究。在植物的生长发育过程中，每种必须的矿质元素都有其独特的功能，各种元素之间互相作用，影响着植物体内一系列的生理生化过程[4]。N在植物体内含量较高，是酶、蛋白质、核酸、生物激素等化合物的重要组成部分，直接或间接地影响植物体内代谢过程[5-6]，对植物生理活动发挥重要的作用[7]。P主要对植物生长发育、细胞分裂、光合作用等过程发挥关键作用，能促进根系发育，提高树木抗寒性和抗旱性，同时也是多种酶的组成部分[8]。K是以离子状态(K+)的形式游离在植物体内，参与细胞代谢和渗透压调节，并对植物体内蛋白质合成起促进作用。N、P、K肥是植物生长发育中所必需的大量元素，研究表明，适当施用N、P、K肥可提高多种植物叶片中可溶性蛋白、丙二醛、过氧化物酶和过氧化氢酶等生理指标的含量，进而提高其抗逆性[9]。

植物营养缺乏症研究主要通过视觉观察和数据比对来进行，传统的育苗肥料试验主要用土壤作为固体基质，但土壤本身就含有大量养分，在进行微量元素和常量元素缺乏症研究时会存在一定困难。越来越多的无土系统研究表明，水培试验对植物营养缺乏症研究更为适宜，对各种矿物质养分的控制更为精准[10-11]。水培试验研究在国外起步较早，1838年德国科学家通过水培试验研究出植物生长发育需要的15种营养元素。1842年，德国科学家威格曼用蒸馏水来栽培植物获得成功，这是开展植物营养液栽培的真正开始[12]。到了20世纪30年代美国科学家Hoagland 和Amon研究出了Hoagland营养液配方，并阐明了在营养液中加入微量元素的重要性，Hoagland营养液配方得到大家的认可并成为了营养液配制的标准配方[13]。

红椿(Toonaciliata)为楝科(Meliaceae)香椿属(Toona)的半常绿乔木，国家Ⅱ级重点保护野生植物，是我国热带、亚热带地区的珍贵速生用材树种，其木材为上等家具用材[14]。现在由于资源过度开发利用，生境破碎化严重，红椿自然更新难度大，种子小、难收集且易丧失活力。为了高效地利用红椿，目前已对其濒危机制[15]、外植体组培研究[16]、扦插技术[17]、容器育苗造林技术[14]、生物活性[18]、丛枝菌根及群落结构[19]等进行研究；且对干旱胁迫及复水下红椿幼苗生理生化响应机制研究比较多，经研究发现，随着胁迫的加深红椿幼苗的抗氧化酶活性先增加后减少，丙二醛(MDA)含量逐渐增加，脯氨酸(Pro)含量逐渐增加[20]；在喷施外源亚精胺后，可以显著提高抗氧化酶活性，且显著减少了MDA和Pro的积累[21]，而对红椿苗期施肥方面研究未见报道。因此，本研究基于改良的Hoagland营养液，通过化合物替代法设置不同N、P、K浓度，研究不同N、P、K水平处理对红椿幼苗可溶性蛋白(Cpr)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)等6个生理指标的影响，探明红椿幼苗生理指标与N、P、K的需求关系，制定出合理的施肥方案，能更好地培育壮苗，缩短苗木出圃时间，促进苗木优质增产。研究结果可为红椿在干热地区植树造林、推广种植等林业发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用苗为种子播种一个月后长势基本一致的幼苗。育苗设施选用周转箱和聚苯乙烯制作而成的育苗托盘。试验用营养液以改良的Hoagland液为母液[22]，其中N、P、K元素的浓度分别为0.015、0.001及0.006 mol/L。本试验以改良的Hoagland营养液配方为依据，保持微量元素及铁盐浓度不变，将N、P、K等3种元素分别配制成原有母液中浓度的0、0.5、1、1.5、2、2.5 倍，即6个水平。缺N处理设计为将母液中的含氮化合物替换为0.002 5 mol/L的K2SO4、0.004 mol/L的CaSO4；缺P处理是将母液中的KH2PO4去除，KNO3浓度调整为0.006 mol/L；缺K处理是将母液中的KNO3去除，KH2PO4替换为0.000 5 mol/L的Ca(H2PO4)2(表1)。

表1 缺素处理Tab.1 Treatment of element deficiency mol/L

1.2 试验设计

本实验用SPSS 16.0作N、P、K3因素6水平正交试验设计，共产生36个处理。每个处理用1个周转箱，一个周转箱内种植12株幼苗，相当于12个重复，共用432株幼苗。试验在云南省林业和草原科学院树木园温室内进行，自然光照、温度和湿度。基于正交试验设计，用纯净水配置不同处理的营养液，每3 d添加一次纯净水到原始水位，每30 d更换一次营养液。在周转箱中添加2～3滴氯霉素滴眼液，防止藻类生长。试验期限6个月。

1.3 测定方法及数据分析

试验结束后叶片采样，同一处理的每株都取样，且每株尽量选取同一部位功能叶片，采取混合样，每个处理三分样，相当于3个生物学重复。

SOD活性采用高锰酸钾滴定法测定[24]，CAT活性采用紫外吸收法测定[23]，采用愈创木酚比色法测定POD的酶活性[23]，Cpr含量测定采用BCA(bicinchonininc acid)法[23]，MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法[24]，Pro含量测定采用磺基水杨酸提取法[23]。

用软件SPSS 18.0 S和Excel 2010对试验数据进行单因素方差分析和多重比较分析，差异显著性在a=0.05水平上用Duncan法进行多重比较分析，所有指标数据表格和柱状图用Excel 作图。

2 结果与分析

2.1 不同处理对红椿幼苗叶片超氧化物歧化酶活性的影响

不同营养液配方条件下，红椿幼苗叶片的SOD活性差异情况如图1所示。红椿幼苗SOD活性在处理29(N2P2K1)时最大，比不添加氮磷钾的处理1(N0P0K0)增加了148.30%，差异显著。处理1与5、6之间差异不显著，数值较低， 29与14、31之间差异不显著，数值较大。

图1 不同处理条件下红椿幼苗的超氧化物歧化酶活性含量注：表中同行不同小写字母代表差异性显著(P<0.05)，下图同。Fig.1 The SOD activity in leaves of T.ciliata seedlings under different treatments

对N、P、K不同水平做多重比较，结果见表2。

表2 氮磷钾不同水平间超氧化物歧化酶活性的多重比较Tab.2 The Multiple comparison of SOD enzyme activity at different levels of nitrogen,phosphorus and potassium U/g

由表2可知，K肥对红椿幼苗SOD活性的影响较N肥、P肥显著。随着N元素浓度的增加，SOD活性随之增强，但是N1.5、N2.0和N2.5三者之间差异不显著，说明是N肥能有效地促进红椿幼苗SOD活性的增强；随着P元素浓度的增强，SOD活性呈现先上升后下降的趋势，P1.0水平时值最大，但是P1.5与P1.0和P2.0之间差异不显著，表明低浓度P肥对红椿幼苗生长有一定的促进作用；随着K元素浓度的提高，SOD活性变化趋势与对P元素的响应相同，在K1.5水平时达到峰值，证明适当浓度的K对红椿幼苗SOD活性有显著促进作用，浓度过高反而抑制酶活性。

2.2 不同处理对红椿幼苗叶片过氧化物酶活性的影响

试验结果表明，红椿幼苗叶片POD活性在29号处理时活性最大，比不添加N、P、K的1号处理增加了233.91%，其次为14号处理(图2)。

图2 不同处理条件下红椿幼苗的过氧化物酶活性Fig.2 The POD activity in leaves of T.ciliata seedlings under different treatments

不同处理间的方差分析结果显示(表3)，随着N、P、K浓度的增加，POD活性显著提高，每种元素的各个水平之间都存在显著差异，且N0、P0、K0水平的POD活性均低于其他水平，说明施肥总体上可以提高红椿幼苗叶片的POD活性。POD活性随着N肥浓度水平的提高显著增强，受N元素影响显著；P0.5水平下的POD活性显著高于其余水平，说明低水平P肥对红椿幼苗叶片的POD活性影响显著，随着P肥浓度水平的提高，红椿幼苗叶片的POD活性呈降低趋势；K1.5水平时POD活性最大，说明适当浓度的K肥可以促进红椿幼苗的POD活性。

表3 氮磷钾不同水平间过氧化物酶活性的多重比较Tab.3 The multiple comparison of POD activity in leaves at different levels of nitrogen,phosphorus and potassium U/g

2.3 不同处理对红椿幼苗叶片过氧化氢酶活性的影响

由图3可知，红椿幼苗的CAT活性同样是在29号处理条件下最高，比对照增加了361.11%，与14号处理间差异不显著。其余处理对CAT活性的影响没有对POD及SOD的显著(P<0.05)。

图3 不同处理条件下红椿幼苗的过氧化氢酶活性Fig.3 The CAT activity in leaves of T.ciliata seedlings under different treatments

由表4可以看出，N、P、K过高或是过低都会显著抑制红椿幼苗的CAT活性。随着各元素的浓度增加，CAT活性均呈先增后降的趋势。其中，N2水平、P0.5和P1水平、K1.5水平下的CAT活性最高，显著高于其余水平，说明较高水平下的N肥和K肥，及较低水平的P肥可以促进CAT活性。

表4 氮磷钾不同水平间过氧化氢酶活性的多重比较Tab.4 The multiple comparison of CAT activity in leavesat different levels of nitrogen,phosphorus and potassium nmol/(min·g)

2.4 不同处理对红椿幼苗叶片丙二醛含量的影响

MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，反映了植物对逆境的适应能力。从图4可看出，MDA含量最低的为处理22，其次为14号和31号，最高的是不添加N、P、K的处理1。其余不同处理水平间的MDA含量差异不显著。

图4 不同处理条件下红椿幼苗叶片的丙二醛含量Fig.4 The MDA content in leaves of T.ciliata seedlings under different treatments

通过多重比较得到表5，可以看出，随着N肥浓度的增加，红椿幼苗叶片的MDA积累的量逐渐减少，N2.5水平时MDA积累最少，其中N0.5、N1、N1.5、N2.5水平之间MDA含量变化差异不显著(P<0.05)；随着P肥和K肥含量的升高，MDA含量都呈现先降后升高的变化，分别在P1.5和K1.5时达到最低值，表明过低或过高水平的P肥和K肥对细胞膜脂过氧化影响不大；适当浓度的P肥和K肥可对保护细胞膜，减弱细胞膜质过氧化有显著作用。

表5 氮磷钾不同水平间红椿幼苗叶片丙二醛含量的多重比较Tab.5 The multiple comparison of MDA content in leaves at different levels of nitrogen,phosphorus and potassium nmol/g

2.5 不同处理对红椿幼苗叶片脯氨酸含量的影响

Pro对不同的N、P、K水平处理的响应变化见图5。红椿幼苗叶片Pro含量最高的为处理29，其次为14号、31号和26号，都显著高于不添加N、P、K肥的处理1。

图5 不同处理条件下红椿幼苗叶片的脯氨酸含量Fig.5 The Pro in leaves content of T.ciliata seedlings under different treatments

通过多重比较分析(表6)，添加了N、P、K肥的红椿幼苗叶片中Pro含量均比不添加N、P、K肥的处理高，证明施肥对Pro的积累有促进作用。N2.5水平时Pro含量最高，说明N肥对Pro积累的影响显著；P0.5水平时Pro含量最高，浓度过高反而会抑制Pro的产生；K肥各个水平之间差异较显著，适当水平的K1对Pro的积累有显著效果。

表6 氮磷钾不同水平间脯氨酸含量的多重比较Tab.6 The multiple comparison of Pro content in leaves at different levels of nitrogen,phosphorus and potassium μg/g

2.6 不同处理对红椿幼苗叶片可溶性蛋白含量的影响

Cpr是植物体内的渗透调节物质。由图6可以看出，红椿幼苗叶片中Cpr含量最高的是处理14，其次为29号和31号，Cpr含量最低的是不含N、P、K肥的处理1。其余处理间差异不是很显著。

图6 不同处理条件下红椿幼苗叶片的可溶性蛋白含量Fig.6 The Cpr in leaves content of T.ciliata seedlings under different treatments

由表7可以看出，红椿幼苗叶片中Cpr含量会随着N元素含量的增加而增加，N0时最低，N1、N1.5、N2、N2.5水平之间的差异不显著，说明高浓度N肥对Cpr积累有促进作用；P1时Cpr含量达到最高值103.23 mg/g，P0与P0.5、P1与P1.5、P2与P2.5之间差异均不显著；K1.5水平时Cpr含量最高，K0与K0.5水平之间不存在显著差异，可以看出低水平K肥对Cpr的积累没有显著效果，随着K肥水平的增加Cpr含量适量增加，但是过高浓度的K会抑制Cpr的积累。

表7 氮磷钾不同水平间可溶性蛋白含量的多重比较Tab.7 The multiple comparison of Cpr content in leaves at different levels of nitrogen,phosphorus and potassium mg/g

2.7 氮磷钾的交互作用

在不同水平N、P、K处理下，除MDA外，N×K和N×P交互对红椿幼苗叶片其余5个生理指标有显著的促进作用，这说明红椿幼苗生理生化过程对N肥的依赖最大； P×K交互对红椿幼苗生理指标无显著影响(表8)。

表8 氮磷钾交互作用对红椿幼苗叶片生理指标的影响Tab.8 The effects of interaction of nitrogen,phosphorus and potassium on physiological indexes of T.ciliata seedlings

3 讨论与结论

3.1 水培条件下氮磷钾与红椿幼苗保护酶的变化关系

POD、SOD、CAT是植物体内重要的保护酶，可帮助植物通过调节自身的保护酶防御系统来维护细胞正常的代谢和反应[25-26]。SOD是植物体内清除活性氧自由基的重要酶类，POD与CAT是主要清除自由基的酶类；CAT能够专一清除H2O2，POD也会在胁迫加剧的时候引发膜质或氧化作用表现为伤害效应。随着N肥水平的增加，POD、SOD、CAT活性呈明显的上升趋势，且表现为先升高后降低的趋势，这与陈彩霞等[20]对干旱胁迫下红椿幼苗抗氧化酶活性变化趋势一样，说明在逆境时，植物体内大量活性氧堆积，超出了抗氧化酶承受范围导致植物加速氧化。N是构成蛋白质的必需组分，尤其是高浓度的N对幼苗抗氧化酶的积累有明显提高作用，这与徐海军等[27]对五味子(Schisandrachinensis)及杨晓清等[28]对土沉香(AquilariaSinensis)的研究结论是一致的。低水平的P肥和适当水平的K肥可促进红椿幼苗的保护酶活性达到最优。

3.2 水培条件下氮磷钾与红椿幼苗细胞膜脂过氧化作用的变化关系

逆境时，植物的最初反应就是增加体内的活性氧代谢，导致积累大量的自由基，引发细胞膜脂过氧化。MDA是细胞膜脂过氧化作用的产物，其含量的高低可以间接判断出细胞膜脂过氧化的程度[29]。本研究发现，MDA含量随着N和K施肥水平的增加逐渐降低，在N2.5和K1.0水平时含量最低；随着P施肥水平的增加，MDA含量表现出先降低后升高的变化趋势，且K肥各水平之间差异不明显，表明K肥对MDA含量影响不大，这与付晓凤等[24]对1 a生扁桃(MangiferapersiciformisC.)的施肥配比研究一致。在P1.5水平时，MDA含量最低，表明N、P、K肥因浓度配比的不同表现出不同的相互协同或拮抗作用，且P合理施用是很重要的。

3.3 水培条件下氮磷钾与红椿幼苗渗透调节物质的变化关系

植物对逆境的代谢反应趋势基本是相同的，大都会增强水解作用，使得植物体内的大分子物质降解为可溶性糖、Cpr、Pro、游离氨基酸等物质来提高细胞液浓度，以降低渗透势[30]。Pro亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低凝固点，有防止细胞脱水的作用。红椿幼苗Pro含量随着N肥的施用水平增加而增加，随着P肥、K肥的施用水平增加表现出先升高再降低的变化，且分别在N2.5、P0.5、K1水平时含量最高，也间接地说明了3种肥料的相互作用，且对P肥比较敏感，少量施用肥效发挥的更好。大多数植物体内的Cpr是参与各种代谢的酶类，是了解植物体内代谢水平的一个重要指标，且Cpr会和Pro相互作用增加蛋白质的亲水性[30]。N元素尤其对Cpr影响较显著，高浓度的N元素对幼苗Cpr积累有明显提高作用，这与周维[31]对格木幼苗做N、P、K配比施肥试验时得到的结果相同。随着P浓度的升高，红椿幼苗Cpr先增加后降低。

N、P、K肥不仅对各指标有不同的促进作用，且肥效的发挥还受三者相互影响的作用，配施合理表现为协调促进作用，配施不合理会出现拮抗抑制作用。从N、P、K肥交互作用可以看出，N×K交互对红椿幼苗生理指标有显著的促进作用，N×P交互次之，P×K交互对红椿幼苗生理指标无促进作用，且各指标值均低于不加氮磷钾处理，这说明红椿幼苗生理生化过程对N肥的依赖最大，且红椿幼苗对P肥比较敏感，低浓度磷肥就能显著地促进红椿幼苗的生理指标，高浓度P反而会产生拮抗作用。本试验可以证明红椿幼苗对N、P、K肥的依赖性为N>K>P。

施肥是加速植物生长发育的重要手段之一，而研究植物对各种矿物营养元素的需求及各种矿物元素之间关系最快速、最简单的就是水培营养系统[26]，与固体基质相比，水培系统可在受控环境中更精准地推断出植物生长所需要的最佳施肥水平。研究表明，以改良的Hoagland液为水培营养液母液，N、P、K水平分别为母液中N、P、K浓度的2倍、2倍和1倍时，红椿幼苗生理指标最佳。本试验结果可为红椿育苗过程中的合理施肥提供理论依据。