响应面法优化茉莉花茶酶解提取茶多酚工艺研究

谢 勇，郑佳颖，孙 昕，林 瑾

(闽江师范高等专科学校， 福建 福州 350108)

茉莉花茶是我国的一种特种茶。现代药理学研究表明，茉莉花茶香可改善人的情绪、能使人集中精神、降压提神、提高工作效率[1]。茶多酚是茉莉花茶中一种主要的活性物质[2]，它具有抗氧化、抗衰老、降血脂、抑制癌细胞活性等多种活性[3]。从茉莉花茶中高效提取茶多酚已成为花茶产业急需解决的问题。高含量茶多酚提取物可用于加工花茶饮品或固体饮料。然而，现有提取茶多酚的方法主要有高温提取法、低温萃取法、超临界流体萃取法、超声波辅助提取法、酶解法等。高温法提取导致茶叶中的有效成分损失较大，能耗大，生产效率低，而低温浸提的提取时间长，水浸提取率低，且茶汤后续需要进行浓缩处理[4]。超临界液体萃取和超声辅助萃取具有较高的活性成分浸出率，速度较快，但设备费用昂贵，投资成本较高[5-6]。生物酶提取法已成为茶叶提取技术的一种新技术手段[7]，可一定程度弥补高温或低温浸提法的不足之处。

茶叶属双子叶植物，其细胞壁由果胶、纤维素、半纤维素和木质素等物质构成，细胞壁强度主要取决于初生及次生壁层[8]。如果水解细胞壁的初生和次生壁层中的纤维素，能使植物的细胞壁分解，从而细胞内活性成分可以有效释放出来[9-10]。外源生物酶可以使茶叶中的有效成分得到更好的扩散和浸出，进而提高浸出物得率。同时，外源生物酶具有酶解条件温和，无环境污染，催化效率高的优点[11]。本试验以茉莉花茶为试材，采用纤维素酶，考察料液比、提取温度、提取时间、茶汤的pH等因素对茉莉花茶茶多酚提取率的影响，并利用响应面法优化茉莉花茶酶解工艺，以得到茉莉花茶多酚提取的最佳参数条件，为茉莉花茶的开发与资源利用、茉莉花茶有效物质的研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

茉莉花茶样品由福建春伦集团有限公司提供。

1.2 试验试剂与仪器

主要试剂：纤维素酶(绿色木霉)(400 U·mg-1)购自上海源叶生物有限公司；无水柠檬酸(分析纯)和柠檬酸钠购自阿拉丁试剂 (上海) 有限公司；硫酸亚铁、酒石酸钾钠、十二水磷酸氢二钠和磷酸二氢钠购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

主要仪器：电子分析天平(AR224CN)购自奥豪斯仪器(上海)有限公司；pH计(PHS-3E)购自上海仪电科学仪器有限公司；数显恒温水浴锅(HH-6S)购自拓赫机电科技(上海)有限公司；可见分光光度计(UV-6100A)购自上海佑科仪器仪表有限公司；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9240A)购自上海精宏实验设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1茉莉花茶酶解方法 准确称取茉莉花茶叶1 g，按单因素设定条件添加一定比例的蒸馏水；调整茶汤的pH，并添加一定量的纤维素酶进行酶解，水浴温度保持不变，酶解结束后快速过滤出茶汤样品，待检测茶多酚含量。

1.3.2茶多酚含量的测定 参考酒石酸亚铁比色法[12]并做略微修改，取2 mL茶汤注入25 mL的具塞试管内，加水至5 mL，再准确移取5 mL的酒石酸亚铁溶液于试管内，倒入pH 7.5的磷酸盐缓冲液至刻度线，迅速摇匀，保持5 min的静置时间。同时配置试剂空白溶液。将待测液移入1 cm的比色皿内，用试剂空白溶液调零，在30 min内，540 nm波长测定吸光值，并利用公式算出茶多酚提取率(%)。

1.3.3单因素条件对茉莉花茶茶多酚提取率的影响 选择纤维素酶添加量、酶解时间、酶解温度、料液比和pH值等单因素条件(表1)，按1.3.1方法酶解，并测定茶多酚含量。

表1 不同单因素酶解条件Table 1 Different single factor enzymatic hydrolysis conditions

1.3.4响应面试验设计 在单因素试验基础上，选择酶解时间90 min、酶解温度50℃试验条件，以酶添加量(A)、液料比(B)、pH值(C)为考查变量，以茶多酚提取率为响应值，采用Box-Behnken响应面法对其工艺进行优化。因素水平见表2。

表2 Box-Behnken Design的因素水平及编码Table 2 Box-Behnken Design factor level and coding

1.4 数据处理

以上各指标测定均重复3次，采用Excel和SPSS19进行数据的统计和分析。

2 结果与分析

2.1 不同单因素条件对茉莉花茶茶多酚提取率的影响

由图1(a)可知，随着纤维素酶添加量的增大，茶多酚提取率逐渐上升。在纤维素酶添加量达20 mg时，茶多酚提取率达到最高值，之后提高酶用量，提取率呈下降趋势。因此，纤维素酶添加量对茉莉花茶中茶多酚的提取效率，在一定水平会达到最高值。由图1(b)可知，随着酶解时间的增加，茉莉花茶茶多酚提取率逐渐上升，在条件为90 min时达到最高值。继续延长提取时间，并没有明显提高茶多酚的提取率。由图1(c)可知，随着酶解温度的升高，茉莉花茶茶多酚提取率持续上升，且无明显下降趋势；即温度越高，茶多酚的提取率越高，且没有拐点。这可能与高温有利于花茶中固形物溶出有关。但随着提取温度的提高，会对茉莉花茶的香气造成损失[13]。且酶解温度高于最佳温度会导致纤维素酶的分子空间被改变，使纤维素酶变性失活，部分酶或者是全部酶变性，从而使酶解反应受到抑制[14]。由图1 (d)可知，随着液料比的增加，茶多酚提取率逐渐升高。在液料比为80∶1时，茶多酚提取率达到最高值。这也验证水加速了茶多酚从茶叶到萃取溶剂水的扩散，从而提高茶多酚提取率。当液料比为100∶1时茶多酚提取率出现回落，表明茉莉花茶中的茶多酚被提取完全，过多溶剂会导致因酶促反应速度减缓引起的茶多酚提取率回落现象。由图1(e)可知，随着pH值的增大，茶多酚提取率在pH值为4.5时便达到了提取率的最高值，在pH 4.5之后茶多酚提取率开始逐渐下降。本试验所用的纤维素酶是从绿色木霉提取，其属于酸性酶。在高pH值的条件下，茶多酚极易被氧化，且茶叶酶解液颜色会呈变暗且茶多酚含量明显下降[15]。

注:(a)不同酶添加量对茉莉花茶多酚提取率的影响；(b)不同酶解时间对茉莉花茶多酚提取率的影响；(c)不同酶解温度对茉莉花茶多酚提取率的影响；(d)不同料液比对茉莉花茶多酚提取率的影响；(e)不同pH值对茉莉花茶多酚提取率的影响图1 不同酶解单因素条件对茉莉花茶茶多酚提取率的影响Fig.1 Effects of different single factor conditions of enzymatic hydrolysis on the extraction rate of tea polyphenols from jasmine scented tea

2.2 Box-Behnken设计数据处理结果

确认了采用三因素三水平进行响应面优化试验时，因此需要进行17组试验得出其结果，得出单因素变量及试验结果，17组设计的茶多酚含量见表3。

表3 Box-Behnken Design方案及数据处理结果Table 3 Box-Behnken Design scheme and the data processing results

2.3 回归模型建立

利用软件对表4进行多元的回归拟合，得到酶添加量(A)与液料比(B)、pH(C) 对茶多酚提取率(R)的回归模型为：

R=15.50+0.081A+0.16B+0.050C+0.12AB+0.12AC+0.025BC-0.23A2+0.041B2-0.14C2

回归模型中的系数绝对值能反映出各因素对茶多酚提取率的影响，其中正负号代表影响方向。通过观察一次项系数的数值可以得出各因素对该茶多酚提取率的影响程度。数据表明，茶多酚提取率(R)受影响的程度为：液料比(B)>酶添加量(A)>pH(C)。

2.4 回归模型的方差分析

为对多元回归拟合方程进行有效性检验，以显著性、多元回归模型方差等进行分析，结果见表4。

表4 茉莉花茶茶多酚提取率回归模型针对方差的分析Table 4 Analysis on the variance of regression model for the extraction rate of tea polyphenols from jasmine scented tea

2.5 响应面交互作用分析

响应面等高线曲线图可以很好地反映出两个因子之间的相互作用，在等高线为圆形时，这两个因子相互作用不明显；在等高线为椭圆或马鞍形时，这两个因子之间的相互作用明显。而响应面的三维曲线上的弯曲度与其对反应值的影响呈正相关，倾斜度越高，坡度越陡，就说明对R的影响程度更大，若曲线平滑则说明两个因素的交互作用对R影响并不明显。

由图2可知，茉莉花茶茶多酚提取率会直接受到酶添加量、液料比的影响，在三维的响应面上表现出明显的斜坡，在响应面的等高线曲线图可以看出等高线间更紧密、呈马鞍形，即两者相互作用对茉莉茶多酚的提取率有很大的影响。

图2 酶添加量和液料比对茉莉花茶茶多酚提取率的相互影响Fig.2 Interaction between the amount of enzyme added and the ratio of liquor to material on the extraction rate of tea polyphenols from jasmine scented tea

由图3可得出相似的结果，在响应面的等高线曲线图可以看出等高线间更紧密、近似椭圆，即酶添加量和pH值对茉莉茶多酚的提取率有很大的影响。

图3 酶添加量和pH值对茉莉花茶茶多酚提取率的相互影响Fig.3 Interaction of the amount of enzyme added and pH on the extraction rate of tea polyphenols from jasmine scented tea

由图4可知，茉莉花茶茶多酚提取率会直接受到液料比、pH的影响。液料比与pH对茶多酚提取率的影响相较于酶添加量与液料比、酶添加量与pH对茶多酚提取率的影响程度较小。与上述的显著性结果一致。

图4 液料比和pH对茉莉花茶茶多酚提取率的相互影响Fig.4 Interaction between the ratio of liquor to material and pH on the extraction rate of tea polyphenols from jasmine scented tea

2.6 提取参数优化及模型验证

通过Design-Expert软件对3种较优检验变量的结合对结果影响的研究，得到了最佳的工艺参数：酶添加量33.8 mg、液料比100∶1、pH 4.8，此时的茉莉花茶茶多酚提取率为15.77%，经过3次平行试验得出茉莉花茶茶多酚提取率为15.89%，试验结果和理论计算值吻合较好，误差较小。本研究结果表明，可以利用该数学模型对酶解法的茉莉花茶茶多酚含量进行准确预测。

3 讨论与结论

酶提取是一种绿色、环保、有效的提取技术。本研究中使用的纤维素酶能够破坏植物细胞的细胞壁，促进茶多酚从茶内的渗透[16]。在一定范围内，酶添加量、酶解温度、酶解时间或pH值均可能影响酶解效果。加大纤维素酶添加量可提高提取率，纤维素酶与底物发生反应的机会就越多，酶的催化效率就慢慢提升[17]，结合纤维素酶在体系中的作用效果，本研究中茶多酚的提取率慢慢升高。当酶用量为20 mg时，茉莉花茶茶多酚提取率可达到15.37%。但是过多的酶添加，则不利于有效成分的溶出，这与前人的结果一致。研究结果表明，茶叶中蛋白可与茶多酚相互结合，二者形成聚合沉淀，间接导致茶多酚提取率回落[18]。

从酶反应进程看，茶多酚提取率在提取初期随时间的延长而上升。这与初期纤维素酶活性高有关，会促其积极与底物发生反应，但随着酶解反应持续进行，所得的产物会堆积，当产物到一定浓度时，则会抑制了酶的活力及酶解反应的进行。长时间对茶叶进行浸泡使得茶叶及茶水收到空气对茶多酚的氧化作用增大，容易发生褐变导致出现茶多酚含量降低的情况[19]。另外，茶叶中含有的一些酚类单宁和花色素也是纤维素酶的一种天然的抑制剂，如果酶在水里过量，会抑制酶的分解。长时间对茶叶进行浸提也会导致大量杂质溶出，茶多酚的析出也就不再明显。因此，需要寻找一个适合提取茶多酚的时间。

pH值对酶的活性有很大的影响，各酶具有最佳的酸碱度，一旦超过最佳酸碱度，都会导致酶的活力下降甚至消失。对最佳pH值的微小偏差，使酶活性部位的基团颗粒发生变化，使酶活力下降；当pH值偏差过大时，酶就会发生变性。由试验结果可知该纤维素酶的最适pH为4.5。在最适pH下，有利于发挥酶的最大活力值，在最适条件下，利用纤维素酶可以使茉莉茶的细胞壁发生损伤，使其传递阻力减小，有利于茶多酚的提取[20]。pH值太高或pH太低，对酶在体系内的反应都存在着不利影响。

在优化试验工艺时，本研究选择的方法为响应面法，用响应面软件辅助完成试验的优化。在优化茉莉花茶酶解工艺研究中，以茶多酚提取率为检测因子，使用纤维素酶(绿色木霉) 400 U·mg-1，酶添加量33.8 mg，液料比为100∶1，pH值在4.8，50℃条件下时酶解90 min。在此操作条件下，经过3次平行试验得出茉莉花茶提取率的实际提取率为15.89%，模型的预测值、实际值二者具有很好的一致性，利用该模型分析酶法提取茉莉花茶茶多酚可靠度高。

本研究选择纤维素酶提取茉莉花茶中的茶多酚，在一定的提取条件下，酶可破坏植物细胞的细胞壁，促使茶多酚更有效溶出，同时利用响应面方法优化并预测最优提取工艺，在此工艺条件下茶多酚提取率为15.89%，接近模型预测值。