血清外泌体miR-17-92a表达水平与行结直肠癌根治术中注射5-氟尿嘧啶治疗的结直肠癌患者预后的关系

唐 斌 丁 俊 蒋叶平 周联明

(1 上海交通大学附属第六人民医院南院普外科，上海市 201499；2 上海市奉贤区奉城医院普外科，上海市 201499)

结直肠癌是临床上较为常见的消化系统恶性肿瘤，近年来，我国结直肠癌的发病率呈逐年升高趋势[1-2]。目前临床上治疗结直肠癌主要以根治性手术为主，患者术后转移和复发是影响治疗效果的关键，也是导致患者死亡的主要原因之一[3]。有研究表明，结直肠癌患者术后复发与手术过程中癌细胞未被完全清除有关，手术中采用抗肿瘤药物干预可有效改善患者的预后[4]。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)是临床上广泛使用的抗肿瘤药物，手术中将5-Fu直接注射在淋巴结、瘤床、癌细胞易脱落种植部位及血管周围等处，可起到抑制肿瘤术后转移、延缓病情复发的作用。miR-17-92a是体内重要的miRNA，其在多种肿瘤患者血清中呈现异常高表达，但miR-17-92a与结直肠癌的关系仍有待进一步研究。因此，本研究探讨了血清外泌体miR-17-92a表达水平与结直肠癌根治术中注射5-Fu的结直肠癌患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年1月至2018年1月期间，在上海交通大学附属第六人民医院南院行腹腔镜下行结直肠癌根治术治疗的93例患者作为观察组，其中男性52例、女性41例，年龄37～65(57.91±7.28)岁；肿瘤分化程度为低分化48例、高分化45例。纳入标准：(1)符合《中国结直肠癌诊疗规范(2015年版)》[5]中相关诊断标准；(2)均经病理学检查确诊；(3)患者意识清晰，可正常配合交流沟通；(4)年龄18～65岁；(5)本次治疗前未接受过其他治疗；(6)知情同意并签署知情同意书。排除标准：(1)存在手术禁忌证者；(2)肿瘤下缘距肛缘5 cm以内者；(3)对5-Fu过敏者；(4)合并严重心、肾、肝脏器疾病者；(5)合并其他肿瘤者；(6)临床资料或随访资料缺失者。选择同期在上海交通大学附属第六人民医院南院进行体检的50例健康体检者作为对照组，其中男性26例、女性24例，年龄36～65(55.12±8.89)岁。纳入标准：(1)意识清晰，可正常交流沟通；(2)年龄18～65岁；(3)知情同意并签署知情同意书。排除标准：(1)合并其他严重器质性疾病或肿瘤者；(2)临床资料缺失。两组研究对象的性别、年龄比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。本研究经上海交通大学附属第六人民医院医学伦理委员会审议并批准。

1.2 治疗方法 所有观察组患者均采用腹腔镜下结直肠癌根治术+5-Fu方案治疗：采用全身麻醉，严格遵照《普通外科腹腔镜手术操作规范与指南》[6]中相关标准进行手术操作，手术中切除肿瘤近端肠管10～15 cm，远端肠管2.5 cm以上，并彻底清扫淋巴结，根据TNM原则切除直肠系膜，取标本送至病理科进行病理检查。然后使用生理盐水冲洗腹腔，取600 mg 5-Fu缓释剂(芜湖先声中人药业有限公司，批号：H20030345)，在邻近的正常组织器官表面注射150 mg，肠系膜血管根部注射250 mg，肿瘤剥离表面注射200 mg，之后进行常规关腹。术后均给予患者抗生素预防感染及营养支持治疗。

1.3 资料收集 收集患者的年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤病理类型、肿瘤浸润深度、远处转移、淋巴结转移等资料。术后随访3年，记录患者的术后生存期。

1.4 外泌体miR-17-92a提取与检测 采集观察组患者术前空腹静脉血5 mL，采集对照组研究对象体检时空腹静脉血5 mL，室温下以2 500 r/min离心10 min后收集血清，采用0.22 μm滤膜过滤，取0.5 mL血清至30 kDa超滤管， 4℃下以10 000 r/min离心30 min滤至剩余100 μL，采用杜氏磷酸盐缓冲液洗涤两次，5 min/次，收集截留物并采用透射电镜观察提取物中的外泌体。取外泌体样品50 μL，使用TRIzol试剂提取总RNA，使用分光光度计检测RNA浓度及纯度，采用TaqMan microRNA反转录试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司，批号：MT0006)将RNA反转录合成cDNA，然后采用实时荧光定量PCR检测两组血清外泌体中miR-17-92a的相对表达水平(miR-17-92a正向引物5′-ACACTCCAGCTGGGACTGCAGTGAAGGCAC-3′，反向引物5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；内参U6正向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′)。PCR反应总体系共20 μL，正向和反向引物各0.8 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，RNase-free ddH2O 6.4 μL，cDNA 2.0 μL。反应条件为：95 ℃预变性10 s；95 ℃变性5 s，66 ℃退火15 s，52 ℃延伸5 s，重复循环45次。以对照组的miR-17-92a/U6比值平均值的1.25倍作为标准，大于此数值即为miR-17-92a阳性表达。

1.5 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计数资料采用例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验；计量资料采用(x±s)表示，组间比较采用两独立样本t检验；采用Kaplan-Meier法绘制不同miR-17-92a表达情况患者的生存曲线。以P<0.05为差异存在统计学意义。

2 结 果

2.1 两组研究对象血清外泌体miR-17-92a表达水平的比较 观察组血清外泌体的miR-17-92a表达水平为3.27±0.84，高于对照组的0.87±0.22(t=25.948，P<0.001)。

2.2 不同临床病理特征结直肠癌患者血清外泌体miR-17-92a表达水平的比较 不同年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度的结直肠癌患者血清外泌体的miR-17-92a表达水平比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)；相比于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移、无远处转移的结直肠癌患者，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期及存在淋巴结转移、远处转移的患者的血清外泌体miR-17-92a表达水平更高(均P<0.05)，见表1。

表1 不同临床病理特征结直肠癌患者血清外泌体miR-17-92a相对表达水平的比较

2.3 不同miR-17-92a水平患者的生存期比较 本研究中，观察组患者血清外泌体miR-17-92a表达阳性66例、阴性27例；血清外泌体miR-17-92a表达阳性的结直肠癌患者术后中位生存时间为31.2个月，血清外泌体miR-17-92a表达阴性的结直肠癌患者术后中位生存时间为33.7个月，血清外泌体miR-17-92a表达阳性的结直肠癌患者术后中位生存时间短于表达阴性者(χ2=12.384，P<0.05)。见图1。

图1 不同miR-17-92a表达水平患者的生存曲线

3 讨 论

腹腔镜下肿瘤根治术是目前临床上治疗结直肠癌的主要方法，该治疗方法具有疗效确切，可有效阻滞病情进展的优点[7]。但也有学者指出，结直肠癌患者在接受腹腔镜手术治疗过程中存在遗漏微小转移病灶的缺点，在手术过程中亦可出现肿瘤细胞异常脱落并在其他部位定植的情况，导致术后复发和转移[8]。有学者在手术期内对患者采用化疗方案干预，发现这一方案可显著改善患者的预后，在术后腹膜播散高危患者中具有极高的临床应用价值[9]。

5-Fu缓释剂是近年来临床中应用广泛的抗肿瘤类药物，其可抑制脱氧胸甘酸合成酶活性，干扰蛋白质、RNA的合成[10]。5-Fu缓释剂是化疗药物氟尿嘧啶经高分子聚合物包裹而成的，注射5-Fu缓释剂后，体液逐渐渗入药粒，使微囊间的药物释放速度得到控制，在注射区域内实现药物的持续释放和浓度累积[11]。有学者发现，在肿瘤周围注射5-Fu缓释剂可使5-Fu持续、缓慢、恒速、稳定、均匀地释放，对体内肿瘤细胞起到高效的杀灭作用[12]。研究表明，胃癌和乳腺癌患者采用5-Fu缓释剂治疗可降低腹腔相关并发症的发生率，且药物的毒副作用轻，临床治疗效果更好[13]。

外泌体是细胞外小囊泡，由肽、脂质、蛋白质、碳水化合物、核酸等组成，其直径在30～100 nm左右，属于细胞外细胞器，含有大量细胞生物分子，对细胞的分化、增殖、免疫反应和死亡起到重要作用[14]。有研究表明，精液、唾液、尿液、血液、胆汁和母乳等多数体液中均可含有外泌体[15]。miRNA属于经典的非编码RNA，非编码RNA不具有蛋白质编码功能，但在多种癌症的发生和发展过程中，miRNA表达明显异常，提示其与肿瘤的发生和发展密切相关[16]。miRNA近年来已成为肿瘤的研究热点，其可作为评估和治疗结直肠癌的重要靶标[17]。有学者发现，在胃癌患者血清中miR-17-92a呈异常高表达，其表达水平与肿瘤TNM分期及分化程度密切相关[18]。还有研究表明，胃癌患者总体生存率与miR-17-92a高表达呈显著相关，miR-17-92a可作为评估胃癌患者预后质量、病理进展及化疗效果的生物学指标[19]。本研究结果显示，结直肠癌患者血清外泌体的miR-17-92a表达水平高于健康对照人群(P<0.05)。进一步分析发现，相比于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移、无远处转移的结直肠癌患者，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、存在淋巴结转移、远处转移的患者的血清外泌体miR-17-92a表达水平更高(均P<0.05)，且血清外泌体miR-17-92a表达阳性的结直肠癌患者术后中位生存期短于表达阴性者(P<0.05)。以上结果表明血清外泌体miR-17-92a异常升高与结直肠癌患者接受结直肠癌根治术联合术中注射5-Fu治疗后的预后相关。

综上所述，结直肠癌患者血清外泌体miR-17-92a mRNA表达水平异常升高，血清外泌体miR-17-92a表达阳性的患者接受结直肠癌根治术联合术中注射5-Fu治疗后的预后较差。但本研究临床样本量较小，且并未对患者行长期随访和追踪，其结论还有待进一步研究。