黏膜免疫佐剂研究进展

张一帜，张 媛，李 建，王秀丽，刘元杰，辛凌翔，任小侠，彭国瑞，宋佳诚，李俊平

（中国兽医药品监察所，北京 100081）

黏膜是机体应对外源病原体的第一道免疫系统防线[1]，能够激发持久有效的黏膜免疫反应对于防御病原体感染大有裨益。然而目前黏膜免疫系统局部保护机制的相关信息还较为匮乏[2-3]，且通过黏膜途径免疫的抗原相对来说产生的免疫反应强度较低[3]。要产生强力而持久的免疫反应，适配于黏膜免疫且安全有效的佐剂就至关重要。一般来讲，佐剂的作用取决于其结构、物化性质、与细胞互作以及抗原类型[4-5]。黏膜免疫佐剂可以根据其功能分为两类：抗原载体型及免疫刺激型。抗原载体型佐剂能够在黏膜表面保护抗原抵抗艰难条件及巨噬细胞的清除作用，如病毒样颗粒、脂质体、古菌体等。免疫刺激型佐剂能够通过直接激活先天性免疫，进一步促进持续性的免疫反应，如LT、CT、TLR受体，以及细胞因子等[6]。

目前通过FDA批准的佐剂主要为铝佐剂，铝佐剂因其稳定的成分结构和较低的免疫原性获得了卫生部门的批准，然而这种传统佐剂无法诱导产生理想的黏膜免疫反应[7]。因此亟需研发新的、安全性良好的、能够承载抗原或激发特定免疫反应的黏膜免疫佐剂，本文整理汇总了目前黏膜免疫佐剂的发展并讨论了部分佐剂发挥其功能的内在原因。

1 抗原载体型佐剂

1.1 病毒样颗粒（VLPs）病毒样颗粒是由重组表达的单个或多个结构蛋白组装成衣壳，再进一步整合形成的多样复合物[8-9]。安全性方面，在颗粒整合过程中没有内部病毒RNA折叠于其中，因而没有感染或增殖的风险，同时将病毒整合酶删除以保证其无法重组或插入宿主细胞的基因组。有效性方面，VLPs作为黏膜免疫佐剂，除自身颗粒蛋白能够额外表达或包裹抗原外（如病原体表位蛋白、共刺激分子、免疫调节蛋白、免疫活性小分子、多肽及多糖类分子等）[8,10-12]，VLPs重复有序的表面特殊结构还能通过PAMPs识别机制激发先天性免疫及抗体的产生[11,13]（图1-1）。有研究使用TLR7和TLR9激动剂作为诺如病毒VLP疫苗的佐剂，经口服或鼻内给药小鼠，都在黏膜局部产生了特异性免疫反应[14]。在预防性HIV疫苗研究中，VLPs佐剂疫苗黏膜免疫后使豚鼠产生特异性抗体。值得关注的是，该研究在VLP中插入了膜锚鞭毛蛋白序列，相较于等量可溶性鞭毛蛋白和常规VLPs组，插入了膜锚鞭毛蛋白序列的VLP作为佐剂能产生更为强力的免疫反应[15]。

1.2 脂质体与VLPs类似，脂质体也是纳米粒子的一种，两者均为自组装磷脂双层包水相，不同点在于脂质体能够形成单层或多层脂质体[8,16]。脂质体类纳米粒子作为疫苗佐剂前景十分广阔，其优势在于能够将药物相对封闭，减少药物降解，能够运输低溶解性药物，通过包被作用将药物运送到靶组织减少了毒性药物对机体的危害[16-17]。脂质体通过内吞作用被抗原递呈细胞吸收，包括其中的抗原、免疫调节分子以及Toll样受体等，激活并增强特异性免疫反应。Christensen等[18]使用脂质体CAF01作为流感疫苗佐剂鼻内给药，小鼠脾脏检测到大量IFN-γ表达，血清中检测到了高水平的特异性IgG，并且发现CAF01脂质体能显著提高黏膜甘露醇单分子层转运并增强抗原融合，同时不影响单分子层的活性和完整性。Henderson等[19]以阳离子脂质体联合非编码质粒DNA佐剂（cationic liposome-plasmid DNA complexes,CLDC）作为黏膜免疫佐剂接种小鼠，发现CDLC能够增强卵清蛋白（Ovalbumin, Ova）在唾液和肺部灌洗液中IgA和血清中IgG1、IgG2的分泌，并且在肺部灌洗液、血液及肺组织中都检测到了持续的抗原特异性CD8+T细胞反应。之后用热灭活类鼻疽伯克氏菌疫苗验证CLDC的佐剂作用，将佐剂疫苗和疫苗分别鼻内给药小鼠，攻毒后40 d，疫苗组5/9存活，佐剂疫苗组9/9存活；攻毒后60 d，疫苗组0/9存活，佐剂疫苗组5/9存活。目前脂质体类黏膜免疫佐剂待解决的问题，主要包括脂酶敏感、包封效率低、抗原泄漏以及低pH环境下稳定性较差（影响经胃肠道途径接种的有效性）等[8,20]。

1.3 古菌体古菌体，即古细菌极化脂质体，为异戊二烯链（通过醚键连接至甘油主链）的支链5碳重复序列[20]。这些颗粒在溶液中形成单层、双层或混合物，具体取决于其中古细菌酚（双层区域）和卡他古醇（单层区域）的脂质组成[21]。这些纳米粒子的独特结构赋予其多种优势，如耐氧化，磷脂酶抗性、胆汁盐抗性、温度变化稳定及低pH稳定[20]。Li等[22]使用Cy5.5联合OVA口服接种小鼠，分别使用脂质体佐剂或古菌体佐剂包封Cy5.5-OVA抗原，所用古菌体由嗜酸热硫化叶菌纯化而得。结果显示，相较于脂质体佐剂，古菌体佐剂能够显著延长抗原在体内存在时间，古菌体佐剂还具备诱导更强的体液免疫反应和细胞免疫反应的能力。在Patel等[23]的研究中，以土拉弗朗西斯菌提取物为抗原，分别以古菌体、霍乱毒素作为佐剂免疫小鼠。结果显示土拉弗朗西斯菌提取物与古菌体佐剂共免疫组能够产生强力的特异性细胞免疫反应和体液免疫反应。在鼻腔攻毒试验中，土拉弗朗西斯菌提取物与古菌体佐剂共免疫组比其他组的保护效果都好。这些研究证明了古菌体的功效及其在黏膜疫苗中的应用，还需进一步的研究阐明其增强体内免疫反应的分子机制，以及评估古菌体对于动物的毒性和免疫原性。

1.4 纳米凝胶纳米凝胶通常由合成聚合物或生物聚合物组成。纳米凝胶的直径不一，能够将适应的抗原包被于载体系统中。Nochi等[24]开发了由阳离子型胆固醇基支链淀粉组成的纳米凝胶。将肉毒梭状芽胞杆菌的无毒亚基包被于纳米凝胶佐剂鼻内给药小鼠，诱导了血清中强特异性IgG和分泌型IgA的抗体应答。另外，鼻内给药疫苗并未导致疫苗于嗅球或大脑中积累，而且该疫苗能够诱导针对破伤风类毒素的强烈特异性全身和黏膜免疫应答。有研究者使用纳米凝胶载体系统开发了肺炎链球菌候选疫苗，通过鼻内给药和肺炎链球菌攻毒试验，在鼠模型上评估疫苗的保护效果。纳米凝胶佐剂疫苗对致死剂量肺炎链球菌的攻击具有保护作用，并在小鼠上、下呼吸道中减少了细菌的定植和侵入，同时，也检测到了免疫组小鼠血清中广泛的特异性IgG，鼻和支气管分泌物中的IgA[25]。目前来说，对于纳米凝胶研究证明了该技术作为黏膜免疫佐剂的良好前景，而制剂配方和给药剂量等重要参数是该技术的突破点，同时还需要更多的研究来评估纳米凝胶在人体中的功效和安全性。

1.5 纳米乳剂纳米乳剂载体系统近年来在黏膜疫苗领域引起了极大的关注，纳米乳剂可以认为是水包油乳剂的纳米级形态，将恰当的载体有机物经过特殊工艺乳化后形成纳米级微粒，再被水相分子所包裹，制成口服乳剂。Das等[26]开发了水包油纳米乳剂流感候选疫苗，给动物鼻内接种并评估其免疫原性和保护效力。在免疫小鼠中检测到了广泛的免疫原性，即流感病毒特异性IgG和IgA，以及高滴度的血凝抑制反应。攻毒后，免疫小鼠肺和鼻甲中的病毒载量均少于对照组。目前纳米乳剂的免疫机制研究还不是很深入。Bielinska等[27]鼻内接种水包油纳米乳剂W805EC能够激活先天性免疫，并通过TLR2和TLR4途径激活NF-κB通路。这种激活机制又不同于传统TLR激动剂，该纳米乳佐剂还能够激活MHCⅡ，CD80和CD86共刺激分子，从而促进树突状细胞激活。在一项临床Ⅰ期研究中，对199名健康成人志愿者鼻内给药后评估了纳米乳剂黏膜佐剂与流感抗原结合的安全性和免疫原性，在受试个体中未观察到任何不良反应。此外，鼻内给药后也检测到良好的全身免疫和黏膜免疫效果（鼻洗液IgA）[28]。目前来看纳米乳剂安全有效，具备良好的应用前景，但该载体系统的稳定性、剂量、颗粒大小还需要更多的研究完善。

2 免疫刺激型佐剂

2.1 LT/CT大肠杆菌热不稳定肠毒素（heat—labde entemtoxin, LT）和霍乱毒素（cholera toxin,CT）被报道作为疫苗佐剂有着增强免疫反应的作用[29-31]。这些毒素高度相似，都能够核糖基化Gs蛋白，促进腺苷环化，产生cAMP9。一般来说，野生型的LT/CT等毒素直接作为佐剂应用是有毒性的，需要进行特定的改造[32-33]。Mutsch等[34]报道，LT作为佐剂的黏膜免疫流感疫苗可能引起受者患贝尔氏麻痹。2009年，Lewis等[35]报道称在结核菌素佐剂人免疫缺陷病毒黏膜免疫途径疫苗Ⅰ期临床安全及有效性验证中，25名受试者中2名出现了贝尔氏麻痹。而目前的解剖学研究也无法彻底排除此类佐剂疫苗黏膜免疫与LT衍生物之间的相关性，新一代的LT和CT佐剂通过位点指向性同源重组等方式进行基因改造[36]，而大多数突变体尝试转移走毒性的同时或多或少影响到突变体促进免疫反应的效果。

LTK63被报道在动物体内能够具有佐剂活性而不展现出酶学活性和毒性[37]。2008年，Brynjolfsson等[38]报道鼻内接种LTK63作为佐剂的脑膜炎球菌（MenC-CRM197）疫苗相比于未添加佐剂组，佐剂疫苗组的新生小鼠产生了更高水平的IgG，并且佐剂疫苗组小鼠血清杀菌效果也有显著提高。此外，研究者还发现相较于皮下注射方式，该佐剂疫苗通过鼻内接种所获得的血清杀菌效果更为出色。2011年，Barrette等[39]发现使用LT63和LTR72（LTR72保留了最低限度的必要酶活性）作为佐剂与口蹄疫病毒TCA肽抗原对猪进行黏膜免疫，猪所产生的血清中抗TCA IgG和IgA水平均显著高于铝佐剂疫苗组。在CT作为免疫佐剂的研究中，由于CT对于人毒性较大，因此首先就是将CT活跃功能位点进行突变以降低毒性。Nedrud等[40]利用CT衍生物CTA1-DD作为佐剂与幽门螺旋菌亚单位疫苗鼻内给药小鼠，之后进行攻毒，佐剂免疫组取得了良好的免疫效果。Elisason等[41]将非毒性皂素片段插入免疫刺激复合物片段（immunostimulating complex, ISCOMS）再与CTA1-DD整合，制备成安全有效的黏膜免疫佐剂载体，再将流感病毒M2基质蛋白中的M2e肽段插入该载体中构建成为DNA疫苗。经黏膜免疫一定天数后攻毒，结果显示CTA1-3Me-DD/ISCOMS免疫小鼠组有100%的流感病毒保护率，剂量依赖性的显著提升T细胞和B细胞反应，免疫反应效果强于ISCOM或CTA1-DD单独免疫组。可以预见未来将会有更多的类LT或CT黏膜免疫佐剂被开发出来，关键点在于产生强力免疫反应的同时限制或移除毒性作用。

2.2 模式识别配体（pattern recognition ligand, PRL）在免疫应答的过程中，抗原递呈细胞（如DC）依靠自身表面的模式识别受体结合外来病原体，激活相应信号通路，表达细胞因子进一步激发相应的免疫反应（图2）[13,42]。哺乳动物的模式识别受体包括Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）、C型凝集素受体（C-type lectin receptors, CLRs）、NOD样受体（NOD-like receptors, NLRs）、RIG-I样受体（RIGI-like receptors, RLRs）和AIM2样受体（AIM2-like receptors, ALRs）等[42-43]。这些模式识别受体能够结合外源病原体上的特异性分子，即为模式识别配体（pattern recognition ligands，简称PRL）。

图2 模式识别受体与配体结合后引起信号通路的激活[13]Fig.2 Binding of TLR and TRL causes signal pathway activation[13]

近年来TLR配体因其能够结合受体激发先天性免疫和持续的适应性免疫受到了广泛的关注，筛选恰当的TRL作为疫苗佐剂是近年来的研究热点。部分PRL能够激活刺激多个TLR进而引起多种细胞因子上调并促进免疫细胞的分化成熟。Domingos等[44]使用CpG-ODN（TLR9激动剂）或poly-(I:C)（TLR3激动剂）作为佐剂与HPV E6/E7治疗性疫苗通过系统黏膜和生殖道黏膜免疫途径接种小鼠，引起了特异性的细胞免疫反应，体现了该佐剂促进免疫反应的效果和作为黏膜免疫佐剂的潜力。2014年，Hjelm等[14]使用诺瓦克病毒VLR与一系列TLR激动剂（TLR3、5、7、7/8和9）通过鼻腔和口腔途径接种动物，在免疫动物的呼吸系统、肠道系统和生殖系统中都产生了特异性的功能抗体。Buffa等[45]使用一系列TLR配体和壳聚糖作为黏膜免疫佐剂在小鼠上进行试验，经舌下腺、鼻腔、阴道黏膜以及肠道外的途径分别进行免疫，结果因免疫途径不同而异。经舌下腺黏膜途径免疫的TLR4激动剂抑制了系统性免疫反应，而经鼻腔和阴道黏膜途径免疫的TLR4激动剂增强了小鼠的免疫反应。此外，TLR9激动剂经舌下腺黏膜和鼻腔黏膜增强了免疫反应，而对于非黏膜途径免疫无影响。而陆晨阳等[46]以CpG-ODN为佐剂对鸭坦布苏弱毒活疫苗无明显的免疫增强效果，并且滞后了抗体产生时间。目前还未有用于人佐剂的TLR激动剂相关研究，而以上临床前研究对于TLR配体作为黏膜免疫佐剂有着重要的参考价值，所激发的特定免疫反应类型、免疫方式、免疫剂量将是TLR配体作为佐剂需要着重考虑的。

2.3 FLT3配体FLT3是属于酪氨酸激酶受体家族的细胞因子受体。FLT3配体在许多人类组织上均有表达，骨髓中也会产生FLT3配体。目前，FLT3配体在疫苗临床和临床前研究中均有使用，Evans等[47]将重组人FLT3配体作为乙型肝炎疫苗佐剂接种健康成年人，结果显示佐剂疫苗组中单细胞及WBCs数量均有增长，但乙肝抗体水平并没有显著变化。2011年，Fukuyama等[48]使用表达FLT3配体和CpG-ODN的重组质粒作为肺炎链球菌疫苗佐剂通过鼻内给药小鼠，能特异性够激发黏膜免疫反应，分泌大量保护性IgA。

2.4 细胞因子细胞因子由多种免疫细胞分泌产生，种类多样，功能多元，能够刺激靶细胞产生相应的免疫反应。参与黏膜免疫的细胞因子能够提高局部的淋巴杀伤性T细胞反应（cytotoxic T lymphocyte,CTL）以及特异性的IgA和IgG的水平。有临床前研究使用IL-1、IL-2、IFN-γ以及GM-CSF作为佐剂均取得了不错的结果。值得关注的是IL-1家族细胞因子，Kayamuro等[49]将IL-1α、IL-1β、IL-18和IL-23作为重组流感病毒H抗原疫苗佐剂鼻内给药小鼠，能显著提升小鼠鼻腔IgA和抗rHA IgG，并且佐剂疫苗组在攻毒试验中存活率要显著高于无佐剂疫苗组小鼠。2002年，Bradney等[50]报道，IL-1α、IL-12和IL-18作为佐剂与HIV包膜合成肽疫苗鼻内给药BALB/c小鼠，相较于疫苗单免组，佐剂疫苗组产生了更高水平的血清IgG，排泄物IgA和IgG1。2014年，Khan等[10]以IL-12和IL-23作为流感疫苗的佐剂黏膜接种小鼠，产生了病毒特异性的鼻腔IgA，并且在攻毒后佐剂疫苗组病毒载量显著低于疫苗单免组。

值得注意的是，鼻腔和胃肠道作为黏膜免疫最常用的靶器官，需要比传统的皮下免疫方式在运输佐剂载体、成本以及整体安全性等方面有更多的考量。Huber等[51-52]报道，人IL-12作为佐剂的临床试验被撤回，因发现其对于部分免疫个体有一定毒性，注射IL-12可能会增加IFN-γ的分泌，这会进一步加剧IL-12的毒性反应[53]。2008年，van Herpen等[54-55]报道，在头颈部鳞状细胞癌患者中使用重组IL-12能有效活化局部淋巴系统并诱导产生自然杀伤性细胞针对癌细胞的杀伤作用。因而将细胞因子应用于黏膜免疫佐剂的过程中，需要谨慎精确地控制好免疫反应的类型及强度，尽量减少免疫反应过激等影响。

3 展望

黏膜免疫途径的特点是抗原免疫原性较弱，因此需要开发适于黏膜免疫的佐剂来提升抗原产生的免疫应答。在现代疫苗制剂产业中，佐剂被认为是先天性免疫和适应性免疫之间的桥梁。一种优秀的佐剂能够通过增加特定细胞因子的产生、诱导产生抗体、免疫类型转换、免疫组织表面传递或更易被抗原递呈细胞摄取来提升疫苗的免疫效果。如前文介绍，近年来有多种纳米粒子和免疫刺激分子作为黏膜疫苗佐剂应用的研究和临床试验，其中部分佐剂因能激发良好的免疫应答而被看好，但将其从研究转化为应用最大的障碍在于专家和管理部门对于此类佐剂复杂性、不稳定性和毒性的担忧。同时，黏膜途径免疫还存在其他问题，比如性别差异导致的不同，男性和女性泌尿生殖道的体液免疫反应的独特性可能会影响佐剂的效力；鼻内免疫可能会因疫苗本身成分和个体差异导致嗅觉神经或鼻上皮损伤；胃肠道中极端条件对于口服或颊含药物及其佐剂的稳定性也是巨大的考验。虽然近年来纳米粒子技术已经取得了长足的进步以应对上述挑战，但该技术还需根据具体情况和应用途径对于组分的配方、载体系统、给药剂量、测试及应用的动物类型等方面进一步开展研究评估。