鼠伤寒沙门菌ompA基因缺失株的构建及生物学特性的分析

张家莉，段世宇，令狐远凤，潘 永，杨 琦,3

（1.贵州大学动物科学学院，贵阳 550025；2.贵州大学动物疫病研究所，贵阳 550025；3.贵州省动物疫病研究室，贵阳 550025；4.贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵阳 550025）

沙门菌（Salmonella）是全世界最常见的引起人畜共患病的病原之一[1]，对我国的畜禽养殖行业造成了严重的威胁，其主要通过食源性传播，在多个国家都可以引起严重危害[2]。鼠伤寒沙门菌是沙门菌的一个重要血清型，是目前分离率最高的菌型之一[3]，也是研究最多的细菌病原体之一，由于其生长条件简单，易培养，因此常用作研究胃肠道感染发病机制的模型[4]。

革兰氏阴性菌含有双层膜，最外层的外膜含有大量的外膜蛋白，且具有包括营养吸收、细胞粘附、细胞信号传递和废物输出等重要的功能。对于致病菌，许多外膜蛋白也作为毒力因子清除营养物质和规避宿主的防御机制[5]。OmpA是革兰氏阴性菌的主要外膜蛋白，同时也是肠杆菌外膜中的主要抗原[6]，可作为大肠杆菌的侵袭素[7]，对入侵脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells,BMEC）至关重要，还可介导部分肠杆菌粘附受体细胞[8]，可作为一种免疫逃逸蛋白避免宿主防御，包括干扰补体激活、抑制细胞因子诱导等[9]，同时也参与细菌生物被膜的形成[10]。关于ompA基因对鼠伤寒沙门菌的生物学特性的影响还未见报道，为进一步了解ompA基因的作用以及对毒力的影响，本研究利用λ-Red同源重组系统敲除ompA基因，研究其生物学特性，为进一步研究外膜蛋白基因ompA的生物学功能及沙门菌致病性奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒以及主要试剂野生型鼠伤寒沙门菌STM LT2，质粒pKD13、STM 7455株（含有质粒pKD46）、质粒pCP21（pKD 46与pCP21均为温敏质粒，37℃时消失）均由CNRS分子遗传学Bossi实验室馈赠。

细菌DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，L-阿拉伯糖购自贵州卓一生物科技有限公司，GreenTaqMix、琼脂糖DNA回收试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 ompA基因缺失株的构建

1.2.1 引物设计 根据NCBI查寻的鼠伤寒沙门菌的全基因组序列（GenBank登录号：AE006468.2）设计引物（表1），P1/P2目的是为扩增打靶片段，下划线序列与ompA基因为同源序列，未加下划线序列为质粒pKD13的kan序列同源。P3/P4为检测kan基因是否成功将ompA基因替换，P5/P6用于检测kan基因是否成功缺失。引物送往生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 构建基因缺失株所用引物Table 1 Primers used to construct gene deletion strains

1.2.2 打靶片段的制备 以质粒pKD13为模板，以P1/P2为引物进行Touchdown PCR扩增。反应体系为50 μL，反应体系为：pKD13模板（10 mg/L）8 μL，P1/P2引物各2 μL，ddH2O 13 μL，GreenTaqMix 25 μL。反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性10 s，55℃复性30 s，72℃延伸1.5 min，共循环5次；95℃预变性10 s，54℃复性30 s，72℃延伸1.5 min，共循环5次；95℃预变性10 s，52℃复性30 s，72℃延伸1.5 min，共循环15次；72℃再延伸8 min。取10 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余产物纯化后进行下一步操作。

1.2.3 STM LT2ΔompA的构建 感受态细胞的制备：挑取STM 7455菌株单菌落接种于5 mL LB中37℃振荡过夜培养，次日1∶100复接与70 mL LB中，加入52 μL 20%的阿拉伯糖，30℃振荡培养至对数早期（OD600=0.2～0.3），用10%甘油洗涤4次后重悬与200 μL的甘油中，每管分装50 μL并置于冰上备用。

一次重组菌株的构建：将已经纯化好的打靶片段按1∶10的比例与感受态细胞混合后进行电转，37℃孵育1 h后取200 μL涂布于Kan抗性平板，37℃过夜培养，次日挑取阳性转化子，利用引物P3/P4进行鉴定。构建成功的基因命名为：STM LT2ΔompA::kn。

二次重组菌株的构建：取1 μL pCP21质粒与50 μL STM LT2ΔompA::kn感受态细胞混合后电转，目的是去除STM LT2ΔompA::kn中的Kan抗性基因，30℃孵育1 h后涂布于Amp抗性平板，30℃过夜培养后挑取单个菌落以P5/P6进行验证，PCR产物送至生工生物工程（上海）有限公司进行测序鉴定。最终获得STM LT2ΔompA。

1.3 生长特性的检测分别将STM LT2与STM LT2ΔompA按1∶100接种于LB培养基中过夜培养，次日转接至20 mL新鲜LB中，调节初始OD600=0.01，37℃、170 rpm振荡培养，每隔1 h分别取样测定OD600的值，共测15次，每株重复3次取平均值并绘制生长曲线图。

1.4 运动能力的测定取过夜培养的菌株按1∶100的比例转接到5 m L新鲜L B中，振荡培养至OD600=0.8～0.9，取2 μL滴加到0.3%琼脂平板中央，37℃正置培养8 h后测量细菌运动圈直径，重复3次取平均值。

1.5 生化特性的测定分别挑取STM LT2、STM LT2ΔompA单个菌落接种于：尿素梅、赖氨酸脱羧酶、葡萄糖、乳糖、卫矛醇、麦芽糖、蔗糖、硫化氢、蛋白胨水（靛基质实验）、半固体琼脂、V-P等生化管鉴定，37℃静置培养24或48 h，观察并记录实验结果。重复3次。

1.6 生物被膜形成的测定将过夜培养的菌株按1∶100接种于YP生物膜诱导培养基（蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 2.5g/L、KH2PO43 g/L、K2HPO47 g/L、(NH4)2SO42 g/L、FeSO40.5 mg/L、MgSO41 g/L、盐酸硫胺素VB12 g/L)，在96孔板中加入150 μL菌液，每个菌做8个重复，37℃静置培养48 h，取出菌液后蒸馏水洗3次，甲醛固定20 min，蒸馏水洗3次，2%结晶紫染色20 min，蒸馏水洗涤后溶解于无水乙醇中，测量吸光度OD575值。

1.7 耐药性检测参照CLSI试验标准，利用K-B纸片法对STM LT2与STM LT2ΔompA进行药物敏感性检测。将各株分别接种于5 mL LB中，37℃过夜培养。次日收集菌体，用无菌PBS调节细菌浓度为0.5个麦氏比浊度，取100 μL菌液涂布于LB固体培养基，贴药敏片，37℃培养24 h后测量抑菌圈直径，重复3次。

1.8 对Caco-2细胞粘附性检测细菌计数：将复苏后的STM LT2与STM LT2ΔompA培养至OD600为0.6左右，用无菌PBS反复清洗3次后重悬细菌沉淀，10倍梯度稀释后取20 μL进行平板细菌计数，做3个重复。

粘附性试验：利用台盼蓝细胞计数法将状态良好的Caco-2细胞进行细胞计数（台盼蓝：细胞=1∶1），将细胞平铺于24孔细胞板中过夜培养，次日，将计数的STM LT2与STM LT2ΔompA用无抗10%MEM重悬，并设置感染细胞的MOI=100，做3个重复。37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育1 h，无菌PBS把未粘附细胞的细菌洗掉，每孔加1 mL 1%Trition X-100，37℃作用10～15 min 裂解细胞，将裂解产物10倍梯度稀释后涂布于LB固体培养基中37℃放置过夜，每个梯度涂3个板，次日进行细菌计数取平均值，比较各菌株的粘附能力。粘附率=（粘附细胞菌数/孔内感染菌数）×100%。

侵袭力试验：感染步骤同粘附性试验，PBS洗涤后加入10% FPS和100 μg/mL庆大的MEM培养基，杀死胞外细菌，侵袭1 h后无菌PBS洗涤3次，将裂解液与无菌PBS（体积比1∶9）混匀后倍比稀释后涂布于LB固体培养基，次日进行细菌计数，比较各菌株的侵袭力力。侵袭率=侵入细胞细菌数/孔内感染菌数×100%。

1.9 半数致死量(LD50)的测定取STM LT2与STM LT2ΔompA过夜菌液，1∶100接种于5 mL新鲜LB中37℃、170 rpm培养至对数期，将全部菌液转移至离心管，8000 ×g离心5 min收集菌体，无菌PBS洗涤2次后加入等体积PBS重悬细菌，进行10倍梯度依次稀释后进行细菌滴板计数。选取28只雌、雄各半KM小鼠随机分为7组，每组4只，其中3组接种鼠伤寒沙门菌野生型STM LT2菌株，另3组为STM LT2ΔompA株，最后一组为空白对照组。分别按照1×105CFU/mL、1×106CFU/mL、1×107CFU/mL的浓度进行腹腔注射，对照组接种等剂量无菌PBS。接种后正常饲喂，每隔12 h记录小鼠死亡情况，连续观察7 d，采用寇式改良法计算LD50。

2 结果

2.1 ompA基因缺失株的构建结果鼠伤寒沙门菌STM LT2ΔompA菌株的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测可知，打靶片段可获得1377 bp片段，第一次重组菌株（STM LT2ΔompA::kn）和二次重组菌株（STM LT2ΔompA）扩增的片段大小分别为519 bp和350 bp（图1）。经测序鉴定后的结果表明，ompA已被成功敲除。

图1 ompA基因缺失株的构建结果Fig.1 Construction result of ompA gene deletion strain

2.2 生长曲线的绘制利用GraphPad prisim 8.0将STM LT2和STM LT2△ompA的在普通液体LB下生长15 h的生长情况绘制成生长曲线。结果如图所示（图2），两种菌株生长速度无明显差异，均在第6 h左右达到对数生长期。此研究表明ompA基因缺失不会影响鼠伤寒沙门菌的生长速率。

图2 生长曲线的绘制结果Fig.2 Drawing results of growth curve

2.3 运动性检测37℃温箱正置培养8 h测量其运动性，结果显示（图3），STM LT2和STM LT2△ompA菌在半固体琼脂平板上所形成的菌环直径基本一致。说明ompA基因缺失不影响鼠伤寒沙门菌的运动性。

图3 运动性检测结果Fig.3 Test results of mobility

2.4 生化特性检测结果经生化培养24～48 h，结果显示：STM LT2和STM LT2△ompA菌均具有运动性，能发酵卫矛醇、硫化氢，能分解赖氨酸、葡萄糖，蛋白胨水（靛基质实验）为阳性，均不能分解蔗糖、尿素酶、乳糖、麦芽糖，V-P试验均为阴性（见表2）。说明ompA基因的缺失不影响细菌的生化特性。

表2 生化鉴定结果Table 2 Biochemical identification results

2.5 生物被膜检测结果利用96孔板对STM LT2和STM LT2△ompA的生物被膜进行定量检测，比较OD575的数值。结果显示，野生型STM LT2的OD575平均值约为0.85，STM LT2△ompA的OD575平均值约为0.51。缺失株生物被膜形成能力明显下降（P＜0.001），说明ompA基因能够影响STM LT2的生物被膜形成。

图4 生物被膜检测结果Fig.4 Test results of biofilm

2.6 耐药性检测结果利用K-B纸片法对标准株以及ompA基因缺失株进行耐药性分析，结果显示（表3），相较于STM LT2，ompA基因缺失株对除新霉素外的各药敏片的抑菌圈明显增大，说明ompA基因的缺失会增加鼠伤寒沙门菌对多种抗生素的敏感性。同时，本研究发现ompA基因缺失后，多粘菌素B的敏感性明显增强，表明ompA可能参与鼠伤寒沙门菌感染中应对体内抗菌肽的杀伤。

表3 药敏试验结果Table 3 Results of drug sensitivity test

2.7 粘附性与侵袭力试验结果分别测定亲本株和ompA缺失株对Caco-2细胞的粘附能力与侵袭力，结果如图5、6所示：与野生型鼠伤寒沙门菌STM LT2相比，ompA缺失株对Caco-2细胞的粘附能力与侵袭力菌明显下降，均下降约79%，且差异极显著（P＜0.001）。因此，ompA基因的缺失可降低鼠伤寒沙门菌的粘附性及侵袭力。

图5 粘附性试验结果Fig.5 Adhesion Results

图6 侵袭力试验结果Fig.6 Invasive Results

2.8 半数致死量（LD50）的测定结果攻毒后，每隔12 h观察一次小鼠状态，发现各实验组小鼠在24 h后出现食欲下降，被毛粗乱、扎堆，反应迟缓，个别小鼠出现双眼或单眼失明等症状，其中STM LT2菌株1×107CFU/mL组小鼠在48 h内全部死亡。利用改良寇氏法计算LD50，lgLD50=Xk- n (ΣP-0.5)，其中Xk为最大剂量对数，P为各组的死亡率，n为相邻两组对数剂量之差，ΣP为各组小鼠死亡率之和。各实验组小鼠死亡情况及LD50如下（表4）。结果显示ompA缺失后，半数致死量为5.2×106CFU，至少是野生型菌株的半数致死量的5倍。以上结果说明，ompA缺失后，可使沙门菌的毒力下降。

表4 STM LT2与STM LT2△ompA的小鼠死亡数与LD50测定结果Table 4 The number of mouse deaths and LD50 determination results ofSTM LT2 andSTM LT2△ompA

3 讨论

沙门菌是全世界最常见的引起人畜共患病的病原之一，具有重要的研究价值，其疫苗的研究正不断成熟，其中基因工程减毒苗是人们主要关注的重点[11]。基于噬菌体的λ-Red同源重组系统能够对特定DNA序列进行增添、缺失或者替换，这种方法利用噬菌体重组蛋白来介导细胞中的同源重组，通过向表达噬菌体重组蛋白的细胞中引入具有短同源侧翼DNA序列的选择性标记，就可以很容易地获得位点特异性染色体基因敲除[12]，且大片段基因缺失后不易发生基因突变，为减毒活疫苗株的安全性奠定了基础，目前正在成为染色体基因工程的一种通用和替代方法[13]。

本研究基于λ-Red同源重组技术成功构建出鼠伤寒沙门菌ompA基因缺失株，通过测量生长曲线、运动性、生化特性发现与标准株STM LT2并无明显区别。细菌生物被膜是附着在细胞表面或者是以聚集体的形式包裹在细胞外基质的微生物群落，可以增强细菌对外界恶劣环境的耐受性，同时参与细菌的耐药性[14]，是影响细菌的毒力的关键因素之一[15]。生物被膜检测发现，ompA的缺失导致鼠伤寒鼠伤寒沙门菌的生物被膜形成能力下降，表明ompA参与细菌生物被膜的形成。由于生物被膜减少，ompA基因缺失株对多种抗生素的敏感性明显增强，同时，本研究发现ompA缺失后对多黏菌素B的敏感性增强，多黏菌素B是多肽类抗生素，可作用于沙门菌外膜脂多糖使细菌死亡，其杀菌机制与宿主免疫系统分泌的抗菌肽相似，因此，多黏菌素B常用作某些细菌的抑制剂[16]，此结果表明ompA可能参与细菌抗菌肽的抑制。粘附性是病原微生物入侵机体的关键引物，有研究表明，ompA可作为一些细菌的黏附素[17]，也可介导细菌侵袭骨髓间质干细胞[18]，同时帮助细菌逃避宿主的免疫抑制机制[19]；本结果显示，ompA缺失后菌株对Caco-2细胞的粘附能力以及侵袭力明显下降，推测其原因可能是由于生物被膜的降低导致细菌的抗逆性及致病性降低，或者对细胞的粘附性降低而导致细菌毒力的下降。由此可见，ompA的缺失可显著降低细菌的毒力。

本研究探索了ompA基因对鼠伤寒沙门菌的生长特性、运动性、生物被膜形成能力、生化特性、耐药性以及对细胞的粘附性和侵袭力的影响，并进行动物回归试验探究了缺失株对小鼠半数致死量的影响。结果表明，ompA会影响细菌的耐药性，生物被膜形成能力细胞粘附性、侵袭力及毒力。本研究为进一步研究外膜蛋白基因ompA基因的生物学功能及沙门菌致病性奠定了理论基础。