仙鹤草配方颗粒中槲皮素含量测定及指纹图谱研究*

俞 杰，侯 静，许豪杰，黄 琪，闻佳涛

（浙江佐力药业股份有限公司研发中心，浙江 湖州 313200）

仙鹤草Agrimonia pilosaLedeb L.始载于北宋苏颂《图经本草》，为蔷薇科多年生草本植物龙芽草的全草，主产于浙江、江苏等地［1-3］，含有黄酮类、三萜类、酚类、酯类、鞣质类等有效成分，具有收敛止血、解毒杀虫、补虚益气强心等功效［4-5］。现代药理学研究表明，仙鹤草有抗肿瘤作用［6］。仙鹤草中的抗氧化成分主要有黄酮类、多酚类和鞣质［7］，黄酮类物质有降血糖作用［8］。对仙鹤草中黄酮类成分的研究发现，其主要含槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素及糖苷［8-9］。目前，《中国药典》中暂未规定仙鹤草质量控制的指标性成分。为此，本研究中对仙鹤草标准汤剂中槲皮素含量及指纹图谱进行研究，为该颗粒制剂质量标准的建立提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；Mettler SX205 型电子分析天平（瑞士Mettler 公司，精度为十万分之一）；FA2004B 型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司，精度为万分之一）；LS220A 型电子分析天平（德国Sartorius 公司，精度为千分之一）；KQ-500VDB型超声波清洗器（昆山超声仪器公司）。

1.2 试药

槲皮素对照品（批号为100081-201610，含量99.1%），仙鹤草对照药材（批号为121464-201303），均购自中国食品药品检定研究院；仙鹤草配方颗粒（浙江佐力药业股份有限公司、批号为19080162，浙江贝尼菲特股份有限公司、批号为1908024，浙江景岳堂股份有限公司、批号为YK2003006，依次记为P1，P2，P3）；乙腈为色谱纯，甲醇、磷酸均为分析纯，水为纯化水。共收集仙鹤草药材16批（记为S1-S16，批号及产地见表1）。

表1 仙鹤草药材的批号与产地Tab.1 Batch numbers and origin of Agrimonia pilosa

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：DIKMA Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.2%磷酸水溶液（28∶72，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：368 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.1.2 样品及溶液制备

标准汤剂：称取药材饮片样品100 g，置煎药锅中，加水煎煮2 次，第一次加饮片量8 倍的水，搅拌，浸润，浸泡30 min，大火加热至微沸，转小火煮沸30 min，药液用100目不锈钢筛滤过；第2次加饮片量6倍的水，大火加热至微沸，转小火煎煮20 min，药液用100 目不锈钢筛滤过，合并2次的滤液，置旋转蒸发器，50～60 ℃减压浓缩至体积约为1∶1 的浸膏，冷冻干燥，即得饮片标准浸膏（汤剂）。

相关溶液：取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇定容，制成质量浓度为11.60 μg/mL 的对照品溶液。取标准浸膏样品和配方颗粒样品各约1.0 g，精密称定，加甲醇-25%盐酸溶液（4∶1，V/V）50 mL，称定质量，加热回流30 min，取出，放冷至室温，再次称定质量，用甲醇-25%盐酸溶液（4∶1，V/V）补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按样品处方工艺取辅料，制成阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.1.3 方法学考察

专属性试验：取配方颗粒供试品溶液（批号为19080162）、对照品溶液、阴性对照品溶液各适量，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱图中，在与对照品溶液色谱相同保留时间处有相应吸收峰，阴性对照无干扰，专属性良好。详见图1。

线性关系考察：量取2.1.2项下对照品溶液2，4，6，8，10，20 μL，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以槲皮素质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得槲皮素回归方程Y=56.191X-7.615 9（R2=1.000 0，n=6）。结果表明，槲皮素质量浓度在2.32～23.19 μg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取2.1.2 项下对照品溶液，按2.1.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果的RSD小于2.0%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.1.2 项下配方颗粒供试品溶液，室温下放置0，2，4，8，12，18，24，36 h 时，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果的RSD小于2.0%（n=8），表明室温下供试品溶液放置36 h内稳定。

重复性试验：取2.1.2 项下配方颗粒供试品溶液6 份，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果的RSD小于2.0%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取配方颗粒样品（批号为19080162），研细，取约0.5 g，共6 份，精密称定，精密加入槲皮素对照品溶液50 mL，混匀，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.1.4 耐用性试验

考察不同色谱柱、柱温、流动相比例及流速对本色谱条件的耐用性，结果见表3。可见，各色谱条件发生一定程度变化时，本方法能满足试验要求，耐用性良好。

表3 耐用性试验结果Tab 1 Results of the durability test

2.1.5 样品含量测定

取16 批标准汤剂样品及3 批配方颗粒样品，依法制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算样品含量。结果见表4。

表4 样品中槲皮素含量测定结果（mg/g，n=2）Tab.2 Results of content determination of quercetin in the samples（mg/g，n=2）

2.2 指纹图谱建立

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：DIKMA Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗 脱（0～20 min 时0%A →20%A，20～30 min 时20%A，30～40 min 时20%A →30%A，40～50 min 时30%A →40%A，50～60 min 时40%A →50%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：250 nm；柱温：30 ℃。结果各峰分离度和峰形均较好。

2.2.2 参照物选择及相关成分确认

标准汤剂化学成分多为黄酮类（主要有槲皮素和芦丁等），考虑到多成分、整体质量控制，以仙鹤草对照药材作对照，为保持对照药材与标准汤剂工艺基本一致，将对照药材以水超声提取，取对照药材约2 g，加水25 mL，加水煎煮30 min，放冷，滤过，蒸干，加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，取出，放冷至室温，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果对照药材与配方颗粒样品色谱图基本一致。

2.2.3 对照指纹图谱建立

按国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，对16批标准汤剂的HPLC 图的色谱峰进行自动匹配，形成共有峰，建立对照指纹图谱。结果见图2。16 批标准汤剂样品的指纹图谱无明显差异，共有5 个共有峰，相对保留时间的RSD为0.00%～1.09%，表明不同产地的饮片制成的标准汤剂具有类似的化学成分，5 个共有峰的相对峰面积的RSD无明显差异，表明不同产地标准汤剂中化学成分含量无明显差异。

2.2.4 相似度计算

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统（2012版）”，以共有峰计算16批样品与对照指纹图谱的相似度，结果整体相似度为0.985～1.000，表明标准汤剂一致性良好。详见表5。

表5 16批标准汤剂指纹图谱相似度Tab.5 Similarity of fingerprints of 16 batches of standard decoction

2.2.5 共有峰标定

将标准汤剂HPLC 指纹图谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”，选择时间宽度为0.1，中位数法生成对照指纹图谱，通过分析共确定5个共有峰。与仙鹤草对照品色谱图进行对比，确认标准汤剂HPLC 指纹图谱中5（S）峰为槲皮素。详见图3。

2.2.6 配方颗粒检测

取3 批配方颗粒样品（批号依次为19080162，1908024，YK2003006），按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，图谱见图4。各共有峰相对保留时间和标准汤剂对照特征图谱基本一致，重复性较好，4 批样品与对照指纹图谱的相似度均大于0.9。表明建立的特征图谱可用于配方颗粒的质量分析。

3 讨论

中药配方颗粒以传统中医药理论为指导，以临床应用为基础，按现代标准化工艺将中药饮片制成颗粒剂，可保障用药准确性和剂量的一致性［10］。2016年，国家药典委员会《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》（征求意见稿）中提出，将标准汤剂作为中药配方颗粒是否与临床汤剂基本一致的标准参照物，用中药饮片标准汤剂作为标准体系，有利于保障临床疗效的一致性，可为中药配方颗粒制备工艺的标准化和产品质量的一致性提供参照［11-14］。中药的成分复杂多样，指纹图谱或特征图谱等可对多组分进行分析，可更好地用于中药质量的整体性评价［15］。

本研究中基于传统煎药工艺，运用现代实验室方法制备仙鹤草饮片标准汤剂，以3批仙鹤草配方颗粒对其进行质量标准研究。饮片产地包含浙江舟山、河南信阳、江苏苏州3 个产地，涵盖了仙鹤草的道地产地和主产区，具有较好的代表性。由于槲皮素在仙鹤草中具有抗氧化作用和降血糖作用［11-12］，药理作用明确，故以槲皮素作为仙鹤草配方颗粒含量测定的指标性成分。

本研究中考察了乙腈-0.2%磷酸水溶液不同比例流动相，发现以28∶72（V/V）为宜，各峰分离度和峰形均较好，保留时间适中，故使用该方法作为流动相。由于中药所含黄酮、蒽醌等活性成分多数有紫外吸收，适用于光电二极管阵列检测器检测［16］。本研究中在200～400 nm 波长范围内对供试品溶液进行扫描，通过等吸收图谱进行分析，发现波长为250 nm 时效果最好，故以其作为检测波长。方法学考察中，仪器精密度、重复性、稳定性、耐用性和中间精密度的RSD均小于3%，表明该方法准确、可行、重复性良好，可用于仙鹤草配方颗粒的质量控制。标准汤剂中槲皮素含量为2.88 mg/g，且不同产地样品含量无明显差异，但不同批次间槲皮素含量存在一定差异，可能受采收时间和贮藏方式的影响。配方颗粒中的槲皮素含量均低于标准汤剂中的含量，考虑受原药材质量差异及制备工艺等因素的影响。后续可进一步探更多指标性成分及其在原药材、标准汤剂、配方颗粒中的量及转移情况。且还需从配方颗粒与标准汤剂及传统汤剂的关联性、差异性等方面，并结合药效物质基础、药理活性等多方面进行研究，为中药配方颗粒质量控制体系的建立提供依据。