金茵利胆口服液高效液相色谱指纹图谱及多成分含量同时测定研究*

赵丽娟，王 信，潘新波，李彩东

（甘肃省兰州市第二人民医院，甘肃 兰州 730046）

金茵利胆口服液（甘药制备字Z20200419000）在我院临床应用已逾20年，由茵陈、广金钱草、枳壳、蒲公英、黄连、甘草等18味中药组方，主要含有蒽醌类、生物碱类、黄酮类、有机酸类等成分，具有疏肝利胆、清热解毒等功效，用于治疗黄疸、慢性肝炎、胆道结石、胆囊炎等症。现行质量标准对方中茵陈、枳壳、蒲公英和五味子进行了薄层色谱定性鉴别，并测定了柚皮苷和新橙皮苷的含量［1］。本研究中参考2020年版《中国药典（一部）》［2］及文献［3-6］，采用高效液相色谱（HPLC）法构建了21 批金茵利胆口服液的指纹图谱，运用主成分分析（PCA）法筛选了批次间的主要差异成分，同时测定了8 种主要有效成分的含量，为建立该制剂的质量控制方法提供了参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20A 型高效液相色谱仪（日本Shimadzu 公司）；FA2004N 型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；XPE105 型电子分析天平（梅特勒托利多仪器＜上海＞有限公司）；TH-100BQ 型超声波提取机（济宁天华超声电子仪器有限公司）。

1.2 试药

没食子酸对照品（批号为110831-200302，含量91.5%），绿原酸对照品（批号为110753-201817，含量96.6%），夏佛塔苷对照品（批号为111912-201703，含量95.6%），甘草苷对照品（批号为111610-201106，含量93.7%），柚皮苷对照品（批号为110722-201111，含量93.2%），新橙皮苷对照品（批号为111857-201102，含量99.6%），盐酸小檗碱对照品（批号为110713-201212，含量86.7%），甘草酸铵对照品（批号为110731-201116，含量93.1%），均购自中国食品药品检定研究院；金茵利胆口服液（医院制剂室自制，批号分别为20181206，20181213，20181220，20190314，20190328，20190411，20190425，20190516，20190530，20190704，20190822，20190919，20190930，20191024，20191107，20191113，20191121，20191128，20191206，20191213，20200116，依次记为S1-S21；规格为10 mL/支）；磷酸、甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为双蒸水。广金钱草（批号为19112202，广西产），茵陈（批号为19090804，甘肃产），黄连（批号为20021002，四川产），厚朴（批号为20021202，四川产），甘草（批号为19111705，甘肃产），香附（批号为19031303，广西产），木香（批号为20021101，云南产），牡丹皮（批号为20020701，河南产），枳壳（批号为19102106，江西产），桃仁（批号为19111905，山东产），川楝子（批号为20021001，四川产），山楂（批号为20021102，山东产），麦芽（批号为19112602，甘肃产），神曲（批号为20020702，甘肃产），南五味子（批号为19040603，广西产），均购自兰州安泰堂药业有限公司；大黄（批号190410，甘肃产），虎杖（批号为B909181-01，甘肃产），蒲公英（批号为190601，甘肃产），均购自兰州九州通医药有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：DIKMA Diamonsil®C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～34 min时93%B→71%B，34～50 min时71%B→65%B，50～60 min 时65%B→0B）；流速：0.9 mL/min，检测波长：254 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

单一对照品溶液：分别称取没食子酸对照品3.18 mg、绿原酸对照品2.96 mg、夏佛塔苷对照品2.13 mg、甘草苷对照品5.07 mg、柚皮苷对照品29.50 mg、新橙皮苷对照品49.64 mg、盐酸小檗碱对照品1.82 mg、甘草酸铵对照品0.51 mg，置不同25 mL 棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为没食子酸0.116 4 g/L、绿原酸0.114 4 g/L、夏佛塔苷0.081 5 g/L、甘草苷0.190 0 g/ L、柚皮苷1.099 8 g/ L、新橙皮苷1.977 7 g/L、盐酸小檗碱0.063 1 g/L、甘草酸铵0.019 0的单一对照品溶液，4 ℃避光保存。

混合对照品溶液：分别取没食子酸、绿原酸、夏佛塔苷、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷、盐酸小檗碱、甘草酸铵对照品4.30，1.45，0.53，1.35，9.23，9.65，0.75，0.30 mg，精密称定，置同一25 mL 棕色容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为没食子酸0.157 4 g/L、绿原酸0.056 0 g/L、夏佛塔苷0.020 7 g/L、甘草苷0.050 6 g/ L、柚皮苷0.344 1 g/ L、新橙皮苷0.384 5 g/ L、盐酸小檗碱0.026 0 g/ L、甘草酸铵0.011 2 g/L的混合对照品溶液，4 ℃避光保存。

供试品溶液：精密量取样品5 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，超声（功率为250 W，频率为50 kHz，下同）处理10 min，放冷至室温，称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，1 000 r/ min 离心10 min，滤过，取续滤液，即得。

2.3 HPLC 指纹图谱研究

2.3.1 方法学考察

精密度试验：取2.2 项下供试品溶液（S1）适量，按2.1 项下色谱条件连续进样6 次，以柚皮苷（11 号峰）为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积。结果的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法精密度良好。

稳定性试验：取2.2 项下供试品溶液（S1）适量，分别于室温下放置0，6，12，24，36，48 h时按2.1项下色谱条件进样测定，以柚皮苷为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积。结果的RSD均小于3.0%（n=6），表明室温下供试品溶液在48 h内稳定。

重复性试验：取样品（S1）适量，精密称定，按2.2项下方法平行制备6 份供试品溶液，分别进样分析，以柚皮苷为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积。结果的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法重复性良好。

2.3.2 特征图谱建立及共有峰定位

取21 批样品，按2.1 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，将所得色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，以样品S1的HPLC 图谱为参照，采用平均数法，设定时间窗宽度为0.1 min，得HPLC 叠加指纹图谱（图1）及对照指纹图谱（图2）。21批样品的色谱图中共有18个共有峰，指认其中8个特征峰，分别为1号峰（没食子酸）、6号峰（绿原酸）、8号峰（夏佛塔苷）、9号峰（甘草苷）、11号峰（柚皮苷）、12号峰（新橙皮苷）、15号峰（盐酸小檗碱）、18号峰（甘草酸铵）。21批样品指纹图谱相似度均在0.947～0.999（见表1），表明各批次样品化学成分相似，制剂工艺稳定。

2.4 主成分分析

采用SPSS 19.0 统计学软件对样品进行主成分分析，发现前3个主成分（PC1，PC2，PC3）分别表征了原始数据的27.289%，22.502%，15.182%，累计64.973%的信息量，且均包含了8种化学成分组成信息。结果显示，盐酸小檗碱和甘草酸铵在PC1中得分较高，新橙皮苷在PC2 中得分最高（0.810），夏佛塔苷和没食子酸在PC3中得分较高，说明这5种成分的含量在不同批次样品间有相对差异，提示在实际生产质控过程中需重点监测。主成分得分系数矩阵见表2。

表2 金茵利胆口服液主成分得分系数矩阵Tab.2 Rotated component matrix of principal components of Jinyin Lidan Oral Liquid

2.5 含量测定

2.5.1 方法学考察

系统适用性试验：精密量取2.2项下混合对照品溶液、供试品溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱中，在与混合对照品溶液色谱相应位置有吸收峰。理论板数按没食子酸峰计应不低于3 000，分离度均大于1.5，基线分离良好。详见图3。

线性关系及检测限、定量限考察：分别精密吸取2.2项下混合对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，7.5mL，置10mL容量瓶中，加50%甲醇定容，制成系列混合对照品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，以进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。以信噪比（S/N）3∶1和10∶1时的进样量记作检测限和定量限。结果见表3。

表3 8个成分的线性关系、线性范围和检测限、定量限（n=6）Tab.3 Linear relationship，linear range，LOD and LOQ of eight components（n=6）

精密度试验：精密吸取2.2项下混合对照品溶液适量，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录色谱图。结果没食子酸、绿原酸、夏佛塔苷、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷、盐酸小檗碱、甘草酸铵峰面积的RSD分别为0.55%，1.31%，0.86%，0.81%，0.76%，1.31%，0.78%，0.81%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（S21），按2.2项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0，6，12，24，48 h时按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果没食子酸、绿原酸、夏佛塔苷、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷、盐酸小檗碱、甘草酸铵峰面积的RSD分别为0.55%，1.10%，0.68%，1.54%，1.33%，2.68%，1.82%，1.39%（n=5），表明室温下供试品溶液放置48 h内稳定。

重复性试验：取样品（S21），按2.1项下方法平行制备供试品溶液6份，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算样品含量。结果没食子酸、绿原酸、夏佛塔苷、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷、盐酸小檗碱、甘草酸铵含量的RSD分别为1.46%，1.68%，1.85%，1.97%，1.96%，1.92%，2.76%，0.17%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取已知含量的供试品溶液（S21）适量，分别加入2.2项下单一对照品溶液，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算加样回收率。结果见表4。

表4 加样回收试验结果（n=6）Tab.4 Results of the recovery test（n=6）

2.5.2 含量测定

取8 批样品，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算各成分的含量。结果见表5。

表5 金茵利胆口服液中8个成分含量测定结果（g/L）Tab.5 Results of content determination of eight components in Jinyin Lidan Oral Liquid（g/L）

3 讨论

3.1 测定指标确定

金茵利胆口服液方中君药茵陈含绿原酸、异绿原酸、咖啡酸等有机酸［7］，广金钱草含皂苷、黄酮苷、生物碱、多糖等成分［8-9］，可清热除湿、利胆退黄。黄连含小檗碱等异喹啉生物碱类，蒲公英含甾醇、有机酸等，虎杖、大黄主含蒽醌类，共为臣药，可利胆排石、通腑泻热。木香、枳壳、厚朴、桃仁等为佐药，可疏肝行气、化郁止痛、软坚散结；五味子、甘草等为使药，可健脾和胃、调和诸药［10］。根据2020年版《中国药典（一部）》及相关文献报道［11-14］，对方中各药材有效成分进行峰归属和含量测定研究［15］，发现厚朴酚、和厚朴酚、丹皮酚、苦杏仁苷、甘草次酸、枸橼酸等在制剂中无法检出，大黄酸、大黄素等蒽醌类成分在煎煮过程中易发生变化，最终确定以没食子酸、绿原酸等8种成分为检测指标。

3.2 流动相和检测波长选择

预试验中考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸、乙腈-磷酸等流动相对检测结果的影响，结果发现，以乙腈-0.1%磷酸水体系为流动相、流速为0.9 mL/min时，色谱峰峰形良好，分离度高，无杂质干扰。全波长扫描发现，没食子酸在215，271 nm 波长处吸收较强，绿原酸在218，326 nm 波长，夏佛塔苷在271，336 nm 波长处吸收较强，柚皮苷、新橙皮苷在283 nm 波长处有最大吸收峰，盐酸小檗碱在228，264，345 nm 波长处有较大吸收峰，甘草苷最大吸收波长在216，276 nm 处，甘草酸铵最大吸收波长在254 nm 处。设定检测波长210，254，326 nm，对比各峰，发现210 nm 波长处存在强吸收杂质峰，326 nm波长处没食子酸、甘草苷基本无吸收，254 nm波长处色谱图基线平稳，各成分在考察范围内线性关系均良好，故选择检测波长为254 nm。

3.3 主成分分析评价

金茵利胆口服液处方含有药材种类多，化学成分复杂，极性差异较大，会对实际质控检测待测物质造成干扰。主成分分析作为一种化学计量学方法，在处理复杂数据降维后代替原始指标，能较充分地反映原始数据信息的特性［16］。本研究中在构建金茵利胆口服液指纹图谱的基础上，应用主成分分析法对21 批样品中8 种成分进行评价，发现盐酸小檗碱、甘草酸铵、新橙皮苷、夏佛塔苷和没食子酸的含量在不同批次样本间存在一定差异。

3.4 方法评价

本研究中建立的金茵利胆口服液指纹图谱，及其中8种成分含量测定方法，简便快速，稳定性、重复性均较好，准确度较高，可用于该制剂的质量评价。