穿山龙总皂苷对去卵巢模型大鼠骨质疏松的改善作用*

司 敏，孙倩舒，丁洪成，黄明炜

（湖北省十堰市人民医院·湖北医药学院附属人民医院内分泌科，湖北 十堰 442000）

骨骼是有机基质矿化而连续形成的组织，成骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨吸收促进了骨重塑平衡，破骨细胞与成骨细胞的形成和功能失衡导致骨质疏松症［1］。绝经后女性卵巢性激素缺乏是引起骨质疏松症的主要危险因素［2］。目前，对于绝经后骨质疏松症，主要采用雌激素替代、双膦酸盐和选择性雌激素受体调节剂等药物治疗，但有一定的药品不良反应（如胃肠道耐受）［3］。有研究表明，部分中药能有效缓解或治疗骨损失［4］。穿山龙总皂苷广泛存在于自然界，具有抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡等多种药理活性，还可促进骨折愈合［5］。本研究中探讨了穿山龙总皂苷对去卵巢模型大鼠骨质疏松的改善作用，以及Wnt/ERK 信号通路［6］在其中起到的作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

1.1.1 仪器

Lunar DPXIQ 型骨密度仪（美国GE Healthcare 公司）；Endura TELELF 3200 型机械测试仪（美国Bose 公司）；DP73 型光学显微镜（日本Olympus 公司）；DH-54152 型紫外-可见分光光度计（美国Thermo Electron公司）。

1.1.2 试药

穿山龙总皂苷（广东省惠州市中药厂有限公司，批号为6365412.63，含量为99.958）；17β-雌二醇（中生北控生物科技股份有限公司，批号为1265963）；Trizol试剂盒（美国Invitrogen 公司，批号为BG-48596.36）；PrimescriptTMRT 试剂盒（宝日医生物技术＜北京＞有限公司，批号为SA-474152.38）；RIPA 裂解缓冲液（批号为SD-526996.48），BCA 试剂盒（批号为CV-569633.36），均购自中国碧云天生物技术研究所；10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE，批号为XZ-56969658.36），电化学发光底物蛋白质印迹试剂盒（批号为XC-585963.3），均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美国EMD Millipore 公司，批号为CB-458582.36）；抗Wnt，ERK，GAPDH 蛋白的一抗（批号分别为sc-47724，sc-47952，sc-47156），羊抗小鼠二抗（批号为BV-2563.36），均购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司；乙二胺四乙酸（EDTA，批号为MN-415895.65），苏木素-伊红（HE，批号为MN-2365.36），均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.1.3 动物

清洁级SD 大鼠100 只，雌雄兼用，体质量为（212.32±25.52）g，购自山东大学实验动物中心，动物生产许可证号SCXK（鲁）2020-01145。喂食标准饲料，自由饮水，并保持环境温度为（25 ± 1）℃，相对湿度为70%，12 h明暗循环。本研究符合《实验动物的护理和使用指南》。

1.2 方法

1.2.1 模型复制及分组、给药

选取80只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，切开腹部约1.5 cm 长的皮肤，暴露腹腔、肌肉，暴露卵巢，用丝线结扎输卵管，切除双侧卵巢［7］，以股骨骨密度（BMD）低于1.0 g/ cm3为去卵巢骨质疏松大鼠模型复制成功。将建模成功的大鼠随机分为模型组（等体积0.9%氯化钠溶液）、17β-雌二醇组（1.6 g/kg）和穿山龙总皂苷低、高剂量组（2 g/kg和4 g/kg）［8］，各20只，灌胃给予相应药物（10 mL/ kg），每天1 次，持续8 周。另取20只大鼠作为正常对照组，灌胃给予等体积0.9%氯化钠溶液。

1.2.2 BMD 检测

末次给药后，处死大鼠，分离双侧后肢股骨组织。采用骨密度仪检测大鼠右股骨的BMD。

1.2.3 股骨生物力学性能检测

采用机械测试仪，将垂直载荷施加到股骨的左中轴和左股骨头的顶部，保持机械负荷速率5 mm/ min，直至股骨中轴和股骨颈断裂。记录断裂负荷数据，包括弹性模量、刚度、最大应力、最大承载力。

1.2.4 组织病理形态学观察

将股骨近端组织以4%多聚甲醛固定48 h，用EDTA 脱钙30 d，石蜡包埋，5 μm 厚切片，二甲苯中脱蜡，经系列乙醇水合后，HE 染色，用光学显微镜观察大鼠股骨近端组织病理形态学。

1.2.5 股骨组织Wnt 和ERK mRNA 表达水平检测

采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法。取大鼠股骨组织，在液氮中研磨成粉末，Trizol 法取总RNA，使用紫外-可见分光光度计和琼脂糖凝胶电泳分别检测RNA 的纯度和浓度，以及RNA 的完整性。反转录制备cDNA，37 ℃逆转录15 min，85 ℃逆转录5 s。Wnt，ERK，GAPDH 引物由中国宝酒生医有限公司合成，序列见表1。PCR反应条件如下，95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，退火20 s，72 ℃延伸34 s（40 个循环）。反应系统包括2 μL DNA 模板，0.4 μL PCR 反向引物（10 μmol/L），0.4 μL PCR正向引物（10 μmol/L），10 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ和7.2μL无菌蒸馏水。以GAPDH作内参，并采用2-ΔΔCt法计算Wnt 和ERK mRNA的相对表达量。各组设3个复孔，实验重复3次。

表1 Wnt，ERK，GAPDH引物序列Tab.1 Primer sequences of Wnt，ERK and GAPDH

1.2.6 股骨组织Wnt 和ERK 蛋白表达水平检测

采用Western blot 法。取1.2.5 项下大鼠股骨组织粉末，加入含PMSF 的RIPA 裂解缓冲液提取总蛋白，以BCA 法检测总蛋白质含量。用10%SDS-PAGE 电泳后转至PVDF 膜上。在含5%脱脂牛奶的TBST 中封闭1 h，加入抗Wnt，ERK，GAPDH 蛋白的一抗，4 ℃孵育过夜，TBST 清洗3 次，加入羊抗小鼠二抗，室温振摇2 h，加入电化学发光底物蛋白质，通过Image J 软件将条带灰度值数字化，目的条带与内参条带灰度比值为各目的蛋白相对表达量。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 股骨BMD

与正常对照组比较，模型组大鼠BMD 显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，17β-雌二醇组及穿山龙总皂苷低、高剂量组大鼠BMD 显著升高（P＜0.05）。详见表2。

表2 各组大鼠股骨BMD比较（，n=20）Tab.2 Comparison of femoral BMD index of rats in each group（，n=20）

表2 各组大鼠股骨BMD比较（，n=20）Tab.2 Comparison of femoral BMD index of rats in each group（，n=20）

注：与正常对照组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，#P ＜0.05。下表同。Note：Compared with those in the normal control group，*P ＜0.05（for Tab.2-5）；Compared with those in the model group，#P ＜0.05（for Tab.2-5）.

2.2 股骨生物力学性能指标

与正常对照组比较，模型组大鼠弹性模量、刚度、最大应力、最大承载力均显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，17β-雌二醇组及穿山龙总皂苷低、高剂量组大鼠的弹性模量、刚度、最大应力、最大承载力均显著升高（P＜0.05）。详见表3。

表3 各组大鼠股骨生物力学性能指标比较（，n=20）Tab.3 Comparison of biomechanical indexes of femoral bone in each group（，n=20）

表3 各组大鼠股骨生物力学性能指标比较（，n=20）Tab.3 Comparison of biomechanical indexes of femoral bone in each group（，n=20）

2.3 股骨组织病理形态学

正常对照组大鼠股骨结构正常；模型组大鼠股骨小梁稀疏，出现空骨空洞；17β-雌二醇组及穿山龙总皂苷低、高剂量组大鼠股骨远端小梁的形态结构改善，股骨小梁密度增加，空骨腔减少，小梁排列有序，且穿山龙总皂苷低剂量组仍可见一定程度的骨质疏松。详见图1。

2.4 股骨组织Wnt 和ERK mRNA 表达水平

与正常对照组比较，模型组大鼠股骨Wnt 和ERK mRNA 表达水平均显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，17β-雌二醇组及穿山龙总皂苷低、高剂量组大鼠股骨Wnt和ERK mRNA 水平均显著升高（P＜0.05）。详见表4。

表4 各组大鼠股骨组织Wnt 和ERK mRNA 表达水平比较（，n=20）Tab.4 Comparison of the expression levels of Wnt and ERK mRNA in femur tissues of rats in each group（，n=20）

表4 各组大鼠股骨组织Wnt 和ERK mRNA 表达水平比较（，n=20）Tab.4 Comparison of the expression levels of Wnt and ERK mRNA in femur tissues of rats in each group（，n=20）

2.5 股骨组织Wnt 和ERK 蛋白表达水平

与正常对照组比较，模型组大鼠Wnt 和ERK 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，17β-雌二醇组及穿山龙总皂苷低、高剂量组大鼠股骨Wnt和ERK蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）。详见表5。

表5 各组大鼠股骨组织Wnt和ERK蛋白表达水平比较（，n=20）Tab.5 Comparison of the expression levels of Wnt and ERK protein in femur tissues of rats in each group（，n=20）

表5 各组大鼠股骨组织Wnt和ERK蛋白表达水平比较（，n=20）Tab.5 Comparison of the expression levels of Wnt and ERK protein in femur tissues of rats in each group（，n=20）

3 讨论

骨质疏松症分为原发性和继发性2种。前者常由衰老和性腺功能下降（如雌激素水平降低）而引起，后者常由其他健康问题和药物（如长期使用皮质类固醇激素治疗）引起［9］。绝经后妇女中约40%受骨质疏松症影响，且随着人口老龄化程度的加剧，这一数字将持续增长。目前临床常使用的治疗药物包括双膦酸盐、抗RANKL、甲状旁腺激素和雷奈酸锶，均可降低初次和反复骨折的风险，但价格昂贵［10］。

本研究结果显示，穿山龙总皂苷可改善去卵巢骨质疏松模型大鼠的骨密度，逆转股骨的微观结构，并增强生物力学性能。同时17β-雌二醇组及穿山龙总皂苷低、高剂量组大鼠股骨组织的Wnt 与ERK mRNA 和蛋白表达水平均高于模型组。提示穿山龙总皂能促进去卵巢骨质疏松模型大鼠股骨组织的Wnt 与ERK mRNA和蛋白表达水平，进而激活Wnt/ERK 信号通路。Wnt/ERK 信号通路参与包括骨骼组织在内的许多组织的生长、发育和维持的重要途径［11］。经典的Wnt/ERK 信号传导极复杂，并受到广泛的反馈控制。在无Wnt 配体的情况下，胞质β-连环蛋白结合APC-Axin-GSK-3β降解复合物，而该复合物中的GSK-3β 磷酸化β-连环蛋白以诱导其蛋白体降解。当Wnt蛋白与受体卷曲蛋白和共受体蛋白LRP5/6 结合时信号蛋白Dsh 被激活，导致丝氨酸/ 苏氨酸激酶（GSK-3β）失活，从而抑制ERK 的泛素化和降解，导致ERK 聚集于细胞核中并与LEF-1/ TCF 结合，以上调成骨细胞中Wnt 靶基因Runx2 和Osx 的表达，从而促进成骨细胞的分化和增殖［12-14］。成骨细胞中的Wnt/ ERK 信号可诱导骨保护素（OPG）的表达，从而抑制破骨细胞的分化［15-16］。LI等［17］的研究显示，成骨细胞的分化减弱，骨髓基质细胞中的脂肪细胞分化增强，表明Wnt/ERK信号是促成骨细胞分化的决定因素［17］。ERK 是Wnt/ ERK 信号通路中的重要蛋白，小鼠ERK 突变失活，其骨量会明显减少［18-20］。

综上所述，穿山龙总皂苷能增加去卵巢骨质疏松模型大鼠的骨密度，逆转股骨的微观结构，并增强生物力学性能。其机制可能与促进股骨组织Wnt与ERK mRNA和蛋白的表达，进而激活Wnt/ERK信号通路有关。