血清TIPE2 在慢性肾小球肾炎中的表达和意义

齐建军，杨麦青，张 林，汪 钊，王艳峰

（1.昌邑市人民医院肾内科，山东 昌邑 261300；2.昌邑市人民医院病理科，山东 昌邑 261300；3.北大荒集团总医院病理科，黑龙江 哈尔滨 150088）

慢性肾小球肾炎（chronic glomerulonephritis，CGN）是一类自身免疫性疾病，是以慢性蛋白尿、血尿、高血压等为主要临床症状的慢性肾炎，其发病机制复杂，病情缓慢且容易反复，且患者的生存质量一般[1]。肾组织炎症反应的严重程度取决于局部促炎因子和保护机制的平衡，早期诊断可以及早干预肾组织的继续损伤，提高患者的生存质量。肾组织穿刺病理诊断是慢性肾小球肾炎的金标准，可以明确肾脏损伤的程度及具体分型，同时可以指导治疗、评估预后[2]，但活检穿刺术的风险较大。寻找能用于CGN早期诊断的临床指标是科研人员研究的热点。肾炎的发病机制复杂，通过肾脏病理改变发现，肾纤维化进展包括肾小管的损伤、间质纤维化和炎细胞浸润在肾炎的发生发展中是一个持续发展的病理过程，包括免疫调控失衡和致纤维化发展的致病因子的作用。肿瘤坏死因子-α 诱导蛋白-8 样分子-2（tumor necrosis factor-α induced protein 8 like 2，TIPE2）是一种免疫负调控分子，也是体内维持免疫动态平衡的必须蛋白之一，可以负性调节免疫反应应答、控制炎症反应[3]。近几年研究显示[4]，文献报道在哮喘、类风湿、恶性肿瘤[5-8]多种疾病中存在TIPE2 表达水平的改变。血清转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）家族成员是多能细胞因子，参与细胞分化、器官发育、创伤愈合和免疫调节等多种细胞过程。TGF-β1在炎症、组织修复和胚胎发育过程中起重要作用，但也能促成一些自身免疫性疾病的发生发展[9-11]。本研究通过检测患者外周血单个核细胞TIPE2 的表达水平和血TGF-β1的表达水平，并结合分析与常见的一般临床特征和临床病理参数及与TGF-β1之间的关系，探讨TIPE2 在CGN 发生发展中的作用和意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018 年10 月-2021 年6 月昌邑市人民医院肾内科住院的初次诊治的CGN 患者45例设为CGN 组，同期健康体检者20 例当作对照组。纳入标准：①年龄≥18 岁；②CGN 组患者经活检病理诊断确诊为原发性肾小球肾炎除外继发性肾小球肾炎及遗传性肾小球肾炎。排除标准：①其他自身免疫性疾病累及肾脏损害；②合并感染；③合并严重心脑血管疾病；④既往肾脏手术史；⑤合并恶性肿瘤；⑥哺乳期女性和孕妇。两组研究对象年龄、性别、体质指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1，研究可比。本研究经过昌邑市人民医院医学伦理委员会审查通过，所有受试者均知情同意并签署知情同意书。根据慢性肾脏疾病（chronic kidney disease，CKD）疾病分期进一步将CGN 患者分为CKD1-2 期26 例，CKD3-5 期19 例，P＞0.05，见表1）。

表1 两组一般资料比较（，n）

表1 两组一般资料比较（，n）

1.2 方法

1.2.1 标本留取 采集所有纳入实验的患者清晨空腹静脉血3 ml，室温下自然凝固，将血样本转移到离心管内，离心取上清液，备用。

1.2.2 血液生化指标 由医院检验科贝克曼库尔特AU5800 全自动生化分析仪检测其中肾功能指标血肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平。

1.2.3 血清学TIPE2、TGF-β1的表达水平检测 抽取受试者空腹血，将1 ml 抗凝血与等量的生理盐水充分混匀，在离心管内加入0.5 ml 淋巴细胞分离液进行分离，离心后管内分为3 层，在中上层交界处的白色云雾层，即单个核细胞层，单个核细胞中TIPE2水平的测定采用实时定量-聚合酶链式反应。提取RNA，然后进行RNA 逆转录和PCR 扩增。使用定量逆转录聚合酶链反应检测基因的表达，以β-actin为参照基因。PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成。所需试剂盒购买自TaKaRa 公司，严格按照说明书进行操作。结果采用2-△CT 法分析。血清TGF-β1采用双抗体夹心ABC-ELISA 法，ELISA 试剂盒购买自R&D 公司，严格按照说明书进行操作，使用美国全自动酶联检测仪测定吸光度，根据标准曲线及标准公式计算受试样本的浓度（pg/ml）。

1.2.4 肾脏病理 所有病例组均在B 超引导下肾穿刺活检，所有活检组织进行HE、PAS、PASM 等常规染色。对肾间质损伤程度进行半定量评分，评分标准参考Katafuchi 评分，肾间质损伤：肾小管萎缩、炎细胞浸润、小管萎缩评分为0～9 分[12]。≤3 分判读为轻度肾间质损伤（24 例），＞3 分判读为中重度肾间质损伤（21例）。CGN 组45 例经肾脏穿刺病理活检，结果分别为系膜增生性肾小球肾炎（16 例）、膜性肾病（7 例）、系膜毛细血管性肾小球肾炎（9 例）和局灶性肾小球硬化（13 例）4 种病理类型，符合CGN 诊断标准。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析。计量资料以（）表示，组间比较采用t检验，计数资料使用（n）表示，比较采用χ2检验、秩和检验，并采用Pearson 相关性分析，ROC 曲线分析TIPE2对于CGN 的诊断敏感性，P＜0.05 表示差异有统计学意义，P＜0.01 表示统计学意义显著。

2 结果

2.1 两组血尿素氮、肌酐、TIPE2、TGF-β1的表达水平比较 CGN 组TIPE2 mRNA 相对表达量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；CGN 组血清尿素氮、肌酐、TGF-β1的表达水平高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1、表2。

表2 两组血清尿素氮、肌酐、TIPE2、TGF-β1 表达水平比较（）

表2 两组血清尿素氮、肌酐、TIPE2、TGF-β1 表达水平比较（）

图1 两组TIPE2 相对表达量比较

2.2 TIPE2 与CGN 患者临床因素分析

2.2.1 TIPE2 与CGN 患者临床因素的关系 对CGN患者根据血清TIPE2 mRNA 相对表达量分为TIPE2低表达组（≤1.5）14 例和TIPE2 高表达组（＞1.5）31 例,分析TIPE2 与患者年龄、性别、体质指数、血清尿素氮、肌酐、TGF-β1、CKD 分期的关系，结果显示，血清TIPE2 mRNA 相对表达量的高低与患者的年龄、性别、BMI 无关（P＞0.05）；与血清尿素氮、肌酐、TGF-β1的表达水平及CKD 分期有关（P＜0.05），见表3。

表3 TIPE2 与CGN 患者临床因素的关系（，n）

表3 TIPE2 与CGN 患者临床因素的关系（，n）

2.2.2 TIPE2 与实验室检查项目的相关性分析Pearson相关性分析TIPE2的表达与Scr、BUN、TGF-β1的相关性的结果显示，TIPE2 的表达与Scr（r=0.300，P=0.022）、BUN（r=0.262，P=0.041）、TGF-β1（r=0.443，P=0.001）的表达分别呈正相关。

2.3 血清TIPE2 表达水平与肾脏病理因素分析 血清TIPE2 mRNA 相对表达量与肾脏间质损伤程度有关（P＜0.05）；而经病理诊断分型中系膜增生性肾小球肾炎、膜性肾病、系膜毛细血管性肾小球肾炎和局灶性肾小球硬化4 种病理类型分组之间TIPE2的表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表4 TIPE2 表达与肾脏病理因素分析（n）

2.4 TIPE2 的ROC 曲线 以血清TIPE2 水平判断CGN，绘制ROC 曲线结果显示，TIPE2 的AUC 为0.739（P＜0.01），见图2。

图2 血清TIPE2 水平的ROC 曲线

3 讨论

CGN 的发病机制非常复杂，对于CGN 的病因学和预防治疗仍没有确切的结果。但自身免疫系统的紊乱在CGN 的发生发展中是关键环节之一。虽然近几年CGN 的治疗有了很大的发展，但CGN 病情的反复性仍然是治疗的难点，在疾病的早期阶段，肾功能损伤较轻，早期发现和早期诊断对于CGN 至关重要，迫切需要寻找CGN 发生发展中可用于早期诊断的新的标记物。

肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导蛋白8（TNFAIP8/TIPE）家族，包括TNFAIP8（TIPE）、TNFAIP8样蛋白1（TNFAIP8L1/TIPE1）、TNFAIP8 样蛋白2（TNFAIP8L2/TIPE2）和TNFAIP8样蛋白3（TNFAIP8L3/TIPE3），在调节炎症反应、免疫稳态和癌症发展中起着重要作用[13]。TIPE2 是该家族的成员之一。近几年研究表明，TIPE2 是炎症反应和免疫稳态的重要调节因子，参与免疫调节。国内外研究报道TIPE2 在类风湿、慢性肝炎、哮喘等多种疾病中出现异常表达[3，4，14]。文献报道TIPE2 在移植排斥反应中有重要的免疫调节作用，显著减少免疫排斥反应，可作为监测慢性肾移植排斥反应的生物标志物[15，16]。在对肿瘤的研究中，发现在肝细胞肝癌、胃癌、乳腺癌中TIPE2 表达降低[5，7，8]，而在肺癌、肾癌、非霍奇金淋巴瘤中表达增高[6，17，18]，提示TIPE2 在人类不同疾病中的作用不同，可能在某种疾病的某个阶段所起的作用不同，也可能跟实验涉及的样本数有关，其具体机制未完全了解。

本研究发现TIPE2 在CGN 患者外周血单个核细胞中的表达高于正常对照组，ROC 曲线结果显示，TIPE2 的AUC 为0.739（P＜0.01），表明TIPE2 可以用于诊断CGN。并且TIPE2 的表达与血清尿素氮、肌酐的表达水平呈正相关，TIPE2 与肾间质损害的程度有关，说明TIPE2 在一定程度上参与了肾炎的发生发展，TIPE2 可以用于评估肾间质的损伤程度，但TIPE2 在肾炎发生发展的作用机制复杂。

但TIPE2 在CGN 中的研究相关报道甚少，在本研究通过对CGN 病理活检的研究发现，TIPE2 与肾脏间质损伤程度有关，而CGN 病情的发展伴随着肾间质炎细胞浸润和肾间质纤维化的发展。肾纤维化是一个动态的病理生理过程，包括肾小管细胞损伤/凋亡、炎症细胞浸润、间质成纤维细胞活化和过量的细胞外基质合成/沉积，导致肾功能受损，最终导致慢性和终末期疾病。TGF-β 通过上调基质蛋白合成、抑制基质降解和改变细胞间相互作用在肾组织纤维化中发挥重要作用[19]；其中TGF-β1具有多种生物学活性，被认为是组织纤维化的关键介质，TGFβ1可以参与CGN 的发展，并能反映CGN 的活动性，TGF-β1是肾纤维化的主要驱动因素[20]。本研究结果显示，CGN 患者血清中TGF-β1表达较正常人显著增高，其在肾组织内的过度表达，可产生明显的致纤维化作用，加重肾间质的纤维化发展，且TIPE2 的表达与TGF-β1呈正相关性，说明TIPE2 在CGN 的发生发展中与TGF-β1的作用有一定关联。

综上所述，TIPE2 在CGN 中的发生发展与TGF-β 通路的作用有一定关联。CGN 患者血清TIPE2、TGF-β1的水平明显增高，TIPE2 与TGF-β1的表达水平呈正相关，血清TIPE2 用于诊断CGN 的敏感性较高。