莪术醇对肝细胞癌miR-629、miR-24、miR-130a、miR-17 的影响

黎桂玉，林基勇

（1.广西中医药大学基础医学院，广西 南宁 530200；2.深圳市中医院感染性疾病科，广东 深圳 518000）

肝癌（liver cancer）是世界上第六大常见癌症，也是癌症死亡的常见原因之一[1]，其死亡率在所有癌症中的排名近年有上升趋势，2018-2020 年，从第四位跃居第三位[1，2]。肝癌是一种高发病率恶性肿瘤，在2020 年全球癌症发病率统计结果中，肝癌占据全世界癌症发病总数的4.7%[1]。就发病率来言，我国属肝癌大国，据世界卫生组织2020 年最新数据显示，全球肝癌发病人数的一半以上出现在中国，其年龄标准化发病率为18.2/105，在全球排名第八，而因肝癌死亡的人数每年达38.3 万人左右，这使我国的肝癌死亡率占全世界一半以上。总之，全球尤其是我国的肝癌疾病负担重，严重威胁公众健康。据2019 年全国肿瘤登记资料记录，广西是肝癌的高发区[3，4]。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原发性肝癌的主要类型，占病例总数的75%～85%[1]。肝细胞癌的主要危险因素是慢性乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus，HBV）或丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染、黄曲霉毒素污染的食物、大量饮酒、超重、2 型糖尿病和吸烟等。在中国，肝细胞癌的发生发展的关键因素是HBV[5]。虽然通过提高卫生标准、筛查血液用品和注射疫苗，HBV 的感染率得到控制，但HBV 的感染率仍然较高。其进一步加重肝细胞癌的疾病负担，给肝细胞癌的治疗增加了难度。肝细胞癌的防治研究是当前学术界的热点和难点，虽然进展显赫，但用于治疗的有效、无副作用药物仍然十分稀缺。因此，迫切需要探索治疗肝癌的替代方法。广西道地药材莪术，在广西境内分布广泛，资源丰富，为广西盛产药材[6-9]。越来越多的研究显示，莪术的有效成分莪术醇有明显的抗肿瘤、抑制肝癌、保肝抗炎的作用[10-13]。小分子核糖核酸（microRNAs，miRNAs）在肝癌中异常表达，调节肝癌发生及发展[14-17]。有研究显示，莪术醇能抑制促癌基因miR-21 的表达从而发挥抗肝癌作用[18-21]；莪术醇可通过调控microRNAs 的表达呈现抑制肝癌的作用[22，23]。miR-629、miR-24、miR-130a 和miR-17 在肝癌发生及进展中发挥重要作用。研究显示，miR-629、miR-24 在肝细胞癌中表达明显升高[24]，miR-130a[25]和miR-17-3P 在肝细胞癌中表达下降。但莪术醇对肝癌miR-629-3P、miR-24-1-3P、miR-130a-5P 和miR-17-3P 表达的调控作用尚不明确。为此，本研究重点探讨莪术醇对肝癌miR-629-3P、miR-24-1-3P、miR-130a-5P 和miR-17-3P 表达的影响，从microRNAs 角度揭示莪术醇抗肝癌的机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人肝癌细胞株HepG2 购于江阴齐氏生物科技有限公司，莪术醇购于北京索莱宝科技有限公司（IC0620），miRcute miRNA isolation kit 购于天根生物科技有限公司（Cat# DP501），氯仿购于天津市永大化学试剂有限公司，无水乙醇购于天津市永大化学试剂有限公司，DEPC 水购于北京索莱宝科技有限公司，miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit 购于天根生物科技有限公司（Cat#KR201），miRcute miRNA Detection Kit（SYBR Green）购于天根生物科技有限公司（Cat# FP401），DMSO 购于Amresco（Cat#D8370）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 取人肝癌细胞株HepG2，于DNEM培养基（含10%胎牛血清、10 U/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素）中，置室温37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 实时荧光定量PCR 检测莪术醇对miR-17、miR-130 和miR-24、miR-629 表达的影响 将培养的HepG2 接种至培养瓶内，3 瓶/组，密度为4×104个/ml，待细胞生长良好，将其分为对照组、不同浓度莪术醇药物组。莪术醇（50、100 μg/ml，少量DMSO 溶解）药物组换入含莪术醇的培养液干预，对照组予少量DMSO，作用48 h 后，提取各组总RNA：加入Trizol试剂，加入氯仿，离心分离，加入异丙醇，离心，乙醇洗涤沉淀，离心，分离白色RNA 沉淀，分光光度计检测RNA 纯度、浓度，特异性逆转目的miRNA，合成相应cDNA，荧光定量PCR 仪检测分析。miR-629-3P、miR-24-1-3P、miR-130a-5P、miR-17-3P 和U6引物序列如下：miR629 -3P：foward 5'TTCTCCCAACGTAAGCCCAGC 3'；miR24 -1 -3P：forward 5'TGGCTCAGTTCAGCAGGAACA 3'；miR130a -5P：forward 5'GCTCTTTTCACATTGTGCTACT 3'；miR17-3P：foward 5'CTGCAGTGAAGGCACTTGTAG 3'；U6（内参）：foward 5'CTCGCTTCGGCAGCACA 3'。

1.3 统计学分析 采用GraphpadPrism 5.0 版软件对数据进行分析。计量资料用（）表示，组间比较行单因素方差分析，P＜0.05 表示差异具有统计学意义，P＜0.01 表示统计学意义显著，P＜0.001 表示统计学意义极显著。

2 结果

两个莪术醇药物组中miR-130a-5P、miR-17-3P 的表达水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；两个莪术醇药物组中miR-629-3P、miR-24-1-3P 表达水平均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；50 μg/ml 莪术醇药物组的miR-17-3P表达水平高于100 μg/ml 莪术醇药物组，差异有统计学意义（P＜0.05）；两个莪术醇药物组其余miRNAs 表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 莪术醇调控肝细胞癌miRNAs 的表达

3 讨论

目前，肝细胞癌的5 年生存率依旧较低[26]，其发病率和死亡率仍较高[1]。索拉菲尼是近年研制的抗肝癌新药，虽对肝癌有一定疗效，但昂贵的费用和严重不良反应使其应用受到限制。因此，关于肝细胞癌的保守替代疗法还需要探索。不断深入探索肝细胞癌的保守替代疗法，寻找不良反应少甚至无毒副作用的药物，提高肝细胞癌患者的生存质量，成为肝细胞癌治疗研究的重点与难点。

目前认为，众多基因和环境因子参与肝癌的发病。近年来，肝细胞癌的治疗已经建立在miRNAs 的基础上。miRNA 最初于2001 年被研究者从线虫、果蝇及人体内发现。miRNA 是一种小型非编码RNA分子，通过绑定目标mRNA 的3’未翻译区（3′-untranslated regions，3′-UTRs）调节基因的表达。人类基因组编码1000 多个miRNAs，超过50%的细胞mRNA 受miRNA 调控。miRNA 对细胞有诸多作用，包括细胞增殖、分化、凋亡和应激反应等有重要调控作用。越来越多的研究报道[27]，miRNAs 通过调控基因表达，使其在诸多癌症如肺癌、结肠癌、骨癌、乳腺癌和肝癌等进展中占据关键地位，而miRNAs 在肝脏疾病和肝癌组织中异常表达。这些研究将为用于肝癌早期诊断生物标记物的开发提供可能[28，29]。有研究报道[30]，miRNA 通过改变免疫微循环，反转免疫耐受，壮大抑制肿瘤的免疫性应答。以往研究证实[31-34]，多种miRAN 在肝癌组织或细胞中反常表达，这些miRANs 是调控肝癌发生、发展的重要因素之一，将逐步成为肝癌治疗的新靶点。

在中医古籍上，肝癌并无对应病名，但相似症状、体征却早有记载。《素问·腹中论》曰：“有病心腹满，旦食不能暮食，此为何病？对曰：名鼓胀”。《圣济总录》：“积气在腹中，久不瘥，牢固推之不移者，癥也……按之其状如杯盘牢结，久不已，令人身瘦而腹大，致死不消。”肝癌当属中医癥瘕、积聚、黄疸等病症范畴。中医学认为，莪术具有祛瘀破血，行气止痛的功效。《日华子本草》言：“治一切气滞……消瘀血，止扑损痛，下血及内损恶血等。”以往研究报道莪术具有抗肿瘤[35-37]、抗肝癌[38-40]的作用。莪术的破血消积，行气止痛功用，对应主治癥瘕、积聚、心腹满痛等病症。无论是从现代药理研究还是从民族医药文献资料记载来看，莪术都具有明显的保肝抗炎、抑制肝癌的作用。莪术含有丰富的挥发油，该挥发油中具有多种活性成分，莪术醇是其主要活性成分之一，属倍半萜烯类物质。莪术醇作为中药莪术的主要有效成分，历年《中国药典》均将莪术醇的含量列为莪术质量监控的标准。越来越多的研究报道，莪术醇具有显著抑制肝癌作用，通过抑制细胞周期蛋白基因的表达，阻断肝癌细胞周期G1期发挥诱导肝癌细胞发生凋亡及抑制其增殖的作用[23,41-44]。

研究显示，miR-629、miR-24 在肝细胞癌中表达明显升高[24]，miR-130a[25]在肝细胞癌中表达下降，miR-17-3P 与肝癌发生及发展密切相关[45]。本研究发现，miR-629、miR-24 在肝癌HepG2 细胞中在治疗前为高表达，与以往研究报道一致[24]，莪术醇作用后其表达下调。miR-130a 及miR-17-3P 在肿瘤中的作用尚存在争议。有研究显示，miR-130a 在肝癌组织中低表达[25]，也有研究显示其可在肝癌细胞中的表达较正常细胞高[46]。同时，有研究显示，miR-17-3P 有抑制肿瘤作用[47]，亦有研究显示其促进肿瘤发展[45]。本研究结果显示，miR-130a、miR-17-3P在肝癌HepG2 细胞中在治疗前为低表达，莪术醇作用后能上调miR-130a、miR-17-3P 的表达。

综上所述，莪术醇可能通过上调miR-130a、miR-17-3P 的表达，下调miR-629、miR-24 的表达，发挥抗肝癌的作用。