侵染番茄的苎麻花叶病毒分子特征及其基因序列分析

李 淳，刘学辉，卜昶栋，姚胜军，王莉爽

（1.贵州省农业科学院植物保护研究所 贵阳 550006；2.贵州医科大学生物与工程学院 贵阳 550025）

番茄是贵州发展蔬菜产业的重要作物之一，而病毒病是危害番茄生产的重要病害。目前，危害我国番茄生产的主要DNA病毒有番茄黄化曲叶病毒（，TYLCV）、广东番茄黄化曲叶病毒（，ToYLCGDV）、中国番茄黄化曲叶病毒（，TYLCCNV）、泰国番茄黄化曲叶病毒（，TYLCTHV）、海南番茄曲叶病毒（，ToLCHNV）、中国番茄曲叶病毒（，ToLCCNV）、台湾番茄曲叶病毒（，ToLCTWV）、烟草曲茎病毒（，TbCSV）和中国番木瓜曲叶病毒（，PaLCuCNV）9种。而目前我国尚未有苎麻花叶病毒（，RaMV）危害番茄的报道。因此，对这一新的番茄病毒的危害，应予以足够的重视以确保我国番茄产业的健康良性发展。按照ICTV最新分类标准，苎麻花叶病毒是双生植物真菌病毒目（）、双生病毒科（）、菜豆金色黄花叶病毒属（）成员，大多数菜豆金色花叶病毒属病毒具有双组分的基因组，即DNA-A和DNA-B，大小在2.5～2.8 kb之间。国内外对双生病毒的研究主要集中在基因组结构、传毒介体、传播途径与寄主的互作等方面。Chen等报道了苎麻花叶病毒在中国广东地区侵染西番莲。Peng等研究发现，苎麻花叶病毒对地中海型烟粉虱行为的改变存在性别差异，雌性烟粉虱的传毒效率明显高于雄性。SHEN等研究发现，蛋白激酶SnRK1的过量表达能使植物对双生病毒的抗性增强，沉默SnRK1会增加双生病毒的易感性，SnRK1还能直接磷酸化双生病毒蛋白以减少感染。Kanakala等研究报道，烟粉虱亲环素B（CypB）和热休克70蛋白（hsp70）在病毒传播途径上与TYLCV在烟粉虱中肠内相互作用并共位点定位，这2种蛋白在病毒传播过程中都有重要作用。目前，国内尚未见到苎麻花叶病毒侵染番茄的相关报道，明确该病毒的株系和变异情况对制定相关的防控策略具有重要的指导作用。笔者运用PCR扩增得到了RaMV的DNA-A和DNA-B，分析了该分离物与其他地区及其他作物上分离物的系统进化关系，并分析了不同地区RaMV各基因的核苷酸一致性，以期为科学防控RaMV提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 感病样品采集与试验 疑似番茄病毒病样品于2019年秋季采自贵州省关岭县，品种为金石头番茄D6689（来源于贵阳粒丰种子有限公司代理）。保存在-80℃冰箱。以未发病的健康番茄植株叶片作为阴性对照。试验于2020年6—7月在贵州省植物保护研究所植物病理实验室进行。

1.1.2 试剂 TransStartFastPfu DNA Polymerase、pEASY-Blunt Simple Cloning Kit、EasyPureQuick Gel Extraction Kit、2×EasyPCRSuperMix（Transgen biotech，AS111）、Trans2KPlus DNA Marker购自北京全式金生物有限公司；其他生化试剂及普通化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 总DNA提取 番茄叶片样本总DNA提取采用CTAB法。

1.2.2 PCR扩增与测序 采用刘勇等报道的通用引物BegoAFor1（5’-TGYGARGGICCITGYAARGTYCARTC-3’）和BegoARev1（5’-ATHCCMDCHATCKTBCTITGCAATCC-3’）进行番茄疑似病毒病样品扩增，酶采用2×EasyPCRSuperMix。反应程序为95℃3 min；95℃15 s，50℃15 s，72℃1 min 12 s，35个循环；72℃5 min。

采用Li等设计的RaMV的DNA-A特异性引 物J4F（5'-CATGTATCGGAAGCCCAAGATG-3'）和J4R（5'-ATGGGCCTGTACGTCCAAGC-3'）扩增DNA-A，体系为Template 2μL，Forward Primer（10μmol·L）1μL，Reverse Primer（10μmol·L）1μL，TransStartFastPfu DNA Polymerase1μL，5X Trans-StartFastPfu Buffer10μL，Nuclease-freeWater 35μL，Total volume 50μL。反应程序为95℃3 min；95℃15 s，50℃15 s，72℃3 min，35个循环；72℃5 min。

设计了RaMV的DNA-B特异性引物RaMV-B-F（5'-TGATCAAGTCCCAGAGGAGATTGAATGC-3'）和RaMV-B-R（5'-AAGGACGATGATAAGAATGGACTGTAC-3'）扩增DNA-B，体系为Template2μL，Forward Primer（10μmol·L）1μL，Reverse Primer（10μmol·L）1μL，TransStartFastPfu DNA Polymerase 1μL，5×TransStartFastPfu Buffer 10μL，Nuclease-free Water 35μL，Total volume 50μL。反应程序为95℃3 min；95℃15 s，50℃15 s，72℃3 min，35个循环；72℃5 min。

PCR扩增产物经回收纯化后克隆到pEASY-Blunt Simple Cloning Kit载体，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经过菌落PCR鉴定后，选取阳性克隆进行测序，引物合成及测序由重庆擎科兴业生物科技有限公司完成。

1.2.3 序列分析 利用DNAMAN和BioEdit对不同地区，不同作物上的RaMV的DNA-A和DNA-B及其编码的各基因进行核苷酸序列相似性比较。运用MEGA 7.0的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建基于DNA-A和DNA-B全长核苷酸序列的系统发育进化树，构建DNA-A和DNA-B系统发育进化树采用的双生病毒分离物序列来源见表1和表2。

表1 不同地区Begomovirus DNA-A分离物及其在国际基因库中收录的情况

表2 不同地区Begomovirus DNA-B分离物及其在国际基因库中收录的情况

2 结果与分析

2.1 疑似双生病毒感染的样品检测

用双生病毒通用引物BegoAFor1/BegoARev1对提取的总DNA进行扩增，得到1200 bp产物（图1），回收后连接至T载体，克隆后送样测序，经过Blast比对，确认其为RaMV序列。

图1 番茄疑似Begomovirus样品检测

2.2 RaMV的DNA-A和DNA-B的全长基因组的克隆与序列分析

以J4F/J4R扩增DNA-A，得到大小2737 bp的条带（图2），以RaMV-B-F/RaMV-B-R扩增DNA-B，得到大小2709 bp的条带（图3），产物经回收、连接、克隆后送样测序，比对结果表明，其序列为RaMV序列，具有菜豆金色花叶病毒属病毒基因结构的典型特征。图4显示，该病毒DNA-A基因组具有6个开放阅读框，病毒链上有AV1（编码外壳蛋白CP）和AV2（编码移动相关蛋白），互补链上AC1（编码Rep蛋白，转录激活及复制相关），AC3（编码REn蛋白，增强复制）和AC4（沉默抑制子）；图5显示，DNA-B具有2个开放阅读框，病毒链有BV1（编码核穿梭蛋白NSP），互补链有BC1（编码运动蛋白MP）。

图2 RaMV-GZDNA-A基因组扩增

图3 RaMV-GZ DNA-B基因组扩增

图4 SnaGene DNA-A全序列分析图

图5 SnaGene DNA-B全序列分析图

对病毒编码的DNA-A和DNA-B及各个基因进行核苷酸序列相似性比较（表3、4），结果表明，其DNA-A与各地的分离物的相似性相差不大，一致性在94.7%～95.5%之间，与RaMV-Zhejiang-Z1（FN396971）、RaMV-Jiangsu-J4（FN396969）和RaMV-Fujian（EF125190）的一致性都是95.5%；而体现在基因方面，则在AC2最为保守，一致性在96.3%～98.0%之间，与RaMV-Guangdong（KC171652）的一致性最高，达到了98%；在AV2变异性最高，一致性在91.9%～96.7%之间，RaMV-Guangdong（KC171652）的变异性最高，一致性为91.9%。DNA-B的相似性则相对低一些，一致性在90.4%～92.4%之间，最高为RaMV-Guangdong-Hn（KC171651）；BC1和BV1的一致性分别为91.2%～93.4%和91.6%～93.1%，一致性最高的都是RaMV-Guangdong-Hn（KC171651）。

表3 DNA-A及其编码基因序列相似性比较 %

表4 DNA-B及其编码基因序列相似性比较 %

2.3 RaMV的DNA-A和DNA-B的系统发育进化树分析

为进一步分析贵州番茄RaMV-GZ分离物与已经报道的各RaMV分离物及其他的亲缘关系，选取了来自国内8个地区的RaMV的DNA-A分离物，同时选取了国内外不同地区已经报道其他13类的DNA-A作为外组利用MEGA7.0软件构建系统进化树（图6）。结果显示，RaMV-GZ的DNA-A与中国其他地区的RaMV DNA-A序列都聚在一个小的分支上。同时，RaMV-GZ的DNA-A与的DNA-A亲缘关系也较近。

图6 基于Begomovirus DNA-A相似性构建的系统发育进化树

选取了来自国内5个地区的RaMV的DNA-B分离物，以及国内外11类的DNA-B作为外组构建系统进化树（图7）。结果显示，RaMV-GZ的DNA-B与中国不同地区的RaMV的DNA-B的序列都聚在一个小的分支上，其与及的亲缘关系也较近。结合DNA-A的系统发育进化树分析结果，贵州侵染番茄的RaMV与中国不同地区不同寄主的RaMV分离物的亲缘关系较近，且地域差异不明显。

图7 基于Begomovirus DNA-B相似性构建的系统发育进化树

3 讨论与结论

据报道，RaMV的寄主有苎麻和烟草及西番莲，而该病毒侵染番茄在我国未见报道。从结果分析，RaMV-GZ的DNA-A与已报道的RaMV分离物的一致性在94.7%～95.5%，DNA-B的一致性为91.2%～93.4%。在双生病毒科病毒同源性比较中，同源性大于89%被认为是同一病毒的不同株系，在此基础上，基因组序列同源性大于94%，则被认为是同一株系的不同分离物。因此，可以认为RaMV-GZ的DNA-B的变异较大，其能侵染番茄也可能是由于DNA-B的变异引起的，具体的机制有待进一步研究。

我国已报道的RaMV主要分布于江苏、浙江、广东等地，而在贵州番茄上的发现是属于在新的地区新的作物上发现了该病毒。笔者通过PCR扩增得到了RaMV-GZ的DNA-A和DNA-B全长，并阐明了其基因组结构，通过Blast比对发现DNA-A与RaMV-Zhejiang-Z1（FN396971）、RaMV-Jiangsu-J4（FN396969）和RaMV-Fujian（EF125190）的一致性都是95.5%，DNA-B与RaMV-Guangdong-Hn（KC171651）一 致 性 为92.4%，通过构建系统进化树确定该分离物DNA-A和DNA-B都属于RaMV。从地域性差异来说，比较的几个RaMV分离物虽然属于不同地区，但相似性都比较高，都在90%以上，说明这些分离物可能有共同的来源。本试验结果对贵州乃至西南地区RaMV的防控、抗病育种等工作具有重要意义。

双生病毒的复合侵染是其遗传重组的重要来源，同时也能加重侵染的症状。田间调查显示非洲木薯花叶病毒（，ACMV）和东非木薯花叶病毒乌干达毒株（，EACMV-UG）复合侵染，2种病毒的协同作用引起木薯花叶病的大流行，导致了巨大的经济损失。而RNA病毒和DNA病毒的复合侵染也会导致症状的加重，如番茄褪绿病毒（，ToCV）与TYLCV在山东及江苏番茄上复合侵染导致番茄病毒病症状加重，且烟粉虱可同时携带这2种病毒传播。在本试验中笔者未发现DNA病毒或RNA病毒的复合侵染，但在同地区的其他样品中检测出了TYLCV和ToCV（本文中未显示结果），不排除有复合侵染的可能性，应对此予以重视。

笔者首次对侵染贵州番茄的RaMV进行分子鉴定和序列分析，明确RaMV贵州分离物的分子特征，为RaMV在我国的传播扩散、自然寄主鉴定和遗传进化分析等方面研究提供了基础，同时也为番茄抗病新品种的选育提供了科学依据。