不同类型甜瓜高效再生体系的建立

张春秋，李斯贝，胡紫玉，吕桂云，王建设

（1.农业农村部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室·蔬菜种质改良北京市重点实验室·北京市农林科学院蔬菜研究中心 北京 100097； 2.河北农业大学园艺学院 河北保定 071001）

甜瓜（L.）属于葫芦科甜瓜属，是一种国内外普遍栽培的水果型作物。2020 年全球甜瓜产量已达2.7×10t，种植面积达1.1×10hm（FAO，www.fao.org/faostat）。随着甜瓜的规模化生产，病虫害的问题也随之日益严重，造成甜瓜产量锐减、品质下降。近年来，基因工程技术快速发展，使得运用转基因技术手段进行种质定向改良成为培育抗病优质甜瓜新品种的有效途径。建立一个稳定、高效的再生体系，是基因工程育种成功的前提条件。

影响甜瓜再生能力的主要因素有基因型、外植体类型及其生长状态、激素种类和浓度配比。基因型对甜瓜再生能力起决定性的作用，不同类型甜瓜的再生潜力有明显差异，已有研究分别针对厚皮和薄皮等不同类型甜瓜建立了特定的再生体系。但甜瓜离体再生过程中仍存在愈伤组织分化出芽困难、不定芽诱导率较低和再生体系重复性差等问题。因此，对不同类型甜瓜再生体系进行系统优化以建立广泛适用的再生体系显得尤为迫切。外植体的类型及生长状态是建立甜瓜再生体系的影响因素之一。目前，已有选用子叶、下胚轴、真叶、叶片等通过器官发生途径再生出完整植株的报道。其中，子叶相比其他器官出愈较快且愈伤组织紧密，不定芽诱导率也相对较高，被认为是甜瓜再生的首选外植体。甜瓜子叶的再生能力与苗龄密切相关，不同苗龄甜瓜子叶的不定芽诱导率存在较大差异，合适的苗龄是成功诱导不定芽的关键因素。影响甜瓜再生的另一个重要因素是生长调节剂的种类和浓度配比。目前，常用于甜瓜再生的激素有6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、吲哚-3-乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等，选择合适的激素种类和浓度配比是建立高效稳定的甜瓜再生体系的研究重点。

笔者在本试验中以不同类型（厚皮、厚薄皮中间型和薄皮）的8 个甜瓜自交系材料子叶作为外植体，对基因型、外植体苗龄、不同激素组合和浓度配比等影响甜瓜再生效率的主要因素进行系统深入研究，以构建适于不同类型甜瓜的高效再生体系，为甜瓜快速繁殖、应用遗传转化技术对甜瓜种质资源进行定向改良等提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

笔者分别以厚皮类型甜瓜M1（sspvar）和M2（sspvar）；厚薄皮类型甜瓜M32 和M36（ssp.var.）；薄皮类型甜瓜M250（ssp.var.）和M265（sspvarMakino）；对照组薄皮甜瓜BU-21/3（sspvar）和厚皮甜瓜Védrantais（sspvar）等不同类型8 个甜瓜自交系作为供试材料。其中，M1、M2、M32、M36、M250 和M265 为北京市农市农林科学院蔬菜中心选育，BU-21/3 和Védrantais种子分别由以色列农业科学院Yaakov Tadmor 研究员和美国农业部J.D.McCreight 研究员馈赠，在北京市农林科学院蔬菜研究中心温室扩繁。其中，Bu-21/3 为具有高再生能力的甜瓜材料，Védrantais为研究甜瓜再生体系常用的材料。试验于2016 年3 月至2019 年10 月在北京市农林科学院蔬菜研究中心进行。以MS 为基本培养基，根据不同生长阶段配制添加不同激素浓度配比。其中，激素种类包括IAA、IBA 和6-BA。以上试剂均购于美国Sigma试剂公司。

1.2 方法

1.2.1 种子处理 挑取饱满的甜瓜种子，剥去种皮后用70%（，后同）的乙醇浸泡20～30 s，无菌水洗2～3 次，用1%的次氯酸钠溶液消毒10 min，无菌水洗涤4～5 次后，用无菌滤纸吸干多余水分，置于MS培养基（蔗糖质量浓度30 g·L，琼脂质量浓度7 g·L，pH 5.8）中暗培养。

1.2.2 不定芽的诱导 取苗龄为3 d 的甜瓜子叶，切除胚根和子叶两端1～2 mm 后，剥除子叶的内种皮，将子叶部分横切为二作为外植体，叶背面向下接种于附加不同激素配比的诱导培养基（见表1），置于25 ℃，光照度为2000 lx，光周期为16 h/8 h 培养。30 d 后调查统计发生不定芽的外植体数，以筛选出不定芽诱导最佳激素配比组合，并比较基因型不定芽诱导率的差异。分别取2、3、4、5 d 苗龄的甜瓜子叶，置于MS+1.0 mg·L6-BA 不定芽诱导培养基中，30 d 后观察不同苗龄外植体不定芽的诱导情况。每个处理30 个外植体，3 次重复。不定芽诱导率/%=产生不定芽的外植体数/接种外植体总数×100。采用SPSS 17.0 软件中的Duncan’s multiple range test 方法进行差异显著性分析。

表1 不同浓度激素配比对不同类型甜瓜材料不定芽诱导率的影响 %

1.2.3 不定芽的伸长与生根 选取厚皮类型M2、厚薄皮类型M32 和薄皮类型M265 三个甜瓜品种进行不定芽伸长和生根试验。不定芽诱导培养3～4周，待丛生芽长至0.5～1.0 cm，及时切下分化的不定芽转入芽伸长培养基（表2），比较不同激素配比对不定芽伸长的影响。当不定芽伸长到2～3 cm 时，切下不定芽，转入生根培养（表3），比较不同激素对不定芽生根的影响。待确定最佳浓度配比后，将生根培养基添加3.0 mg·L的活性炭防止形成玻璃苗。生根率/%=生根的不定芽数/接种的总不定芽数×100。1.2.4 试管苗的移栽 待试管苗根系发达后，炼苗3～5 d 后，洗净根上附着的培养基，移栽入预先经高压灭菌的蛭石和草炭土1∶1（∶）基质中于温室中培养，前期注意保湿遮阴，3～5 d 后逐渐增加透光量。

表3 不同激素浓度对生根率的影响

2 结果与分析

2.1 不同类型甜瓜材料和激素配比对甜瓜不定芽诱导的影响

由表1 可以看出，不同类型甜瓜在含相同激素浓度配比的培养基中不定芽诱导率表现有所不同，薄皮型甜瓜M250 和M265 不定芽诱导率高于厚皮和厚薄皮类型。此外，不定芽的诱导和分化与6-BA 和IAA 的质量浓度配比密切相关。随着6-BA 和IAA 质量浓度的增加，不定芽的诱导率随之降低，8 个不同甜瓜材料在MS8（MS+2.0 mg·L6-BA+0.6 mg·LIAA）不定芽诱导率最低。分析发现在含1.0 mg·L6-BA 的培养基中添加低质量浓度的IAA（0.2 mg·L）对不定芽的诱导影响较小，8 个不同类型甜瓜材料在MS1（MS+1.0 mg·L6-BA）和MS2（MS+1.0 mg·L6-BA+0.2 mg·LIAA）上的不定芽诱导率均没有显著性差异。不同基因型甜瓜材料的不定芽诱导最佳培养基有所不同，对照组（BU-21/3 和Védrantais），厚皮型（M1 和M2），厚薄皮类型（M32 和M36）和薄皮型M265 在MS1 培养基中不定芽诱导率最高，分别为90.3%、87.3%、72.0%、83.0%、73.6%、75.6%和89.3%。其中，对照组BU-21/3 不定芽诱导率最高，薄皮型M265 表现出与对照组相近的较强再生能力。薄皮型甜瓜M250 在MS2 培养基上诱导率最高（85.3%），但其在MS1 培养基上同样具有较高的诱导率（84.7%）。综合考虑，不同甜瓜材料后续试验采用的不定芽诱导培养基配方为MS+1.0 mg·L6-BA。

2.2 不同苗龄子叶外植体对不定芽诱导的影响

由图1 可知，不同基因型甜瓜在2 d 苗龄时子叶块不定芽诱导率最低，3～4 d 苗龄的子叶块不定芽的诱导率相对较高，在72%～90%之间。进一步分析发现，不同基因型材料均在苗龄为3 d 时表现出的不定芽诱导率最高，苗龄增大后诱导率均有所下降。因此，最好采用3 d 苗龄的子叶作为外植体进行甜瓜再生培养。

图1 苗龄对子叶块不定芽诱导率的影响

2.3 不定芽伸长和生根条件优化

M2、M32 和M265 三个不同类型材料在不同激素浓度配比的培养基上不定芽生长状态较为一致，在高浓度6-BA 的MS 培养基上生长较快，但容易形成玻璃化苗，6-BA 的质量浓度为0.1 mg·L时能满足不定芽的伸长生长需求，且不定芽叶色深绿，节间适中，茎较粗。添加微量的IAA 有助于茎的正常生长，当IAA 浓度较高时，不定芽生长较快，节间变长且茎较细，在一定程度上还会加重幼苗的玻璃化现象。因此，MS+0.1 mg·L6-BA+0.05 mg·LIAA 是适于不定芽伸长的最佳培养基，在此条件下生长的试管苗叶色深绿、节间适中、生长健壮，2 周左右生长成2～3 cm 高的健壮苗（表2，图2）。

表2 不同激素浓度对甜瓜不定芽伸长的影响

图2 M1 甜瓜组培苗再生过程

待不定芽伸长至2～4 cm 时，将其移入生根培养基中诱导生根。结果表明，相较于高浓度IBA 培养基，添加低质量浓度0.1 mg·LIBA 诱导生根率较高，M2、M32 和M265 的生根率分别高达86.7%、91.1%和89.2%，并且根系形态正常、较为粗壮、须根较多。随着IBA 浓度的升高，生根率逐渐降低，3种类型甜瓜材料在含0.5 mg·LIBA 的培养基上生根率与0.1 mg·LIBA 相比显著降低，根系明显变细且根量减少。在培养基中添加不同浓度的IAA时，厚皮型M2 和厚薄皮M32 的生根率无显著性差异；薄皮类型M265 在0.1、0.3 mg·LIAA 的培养基上生根率差异显著，但均低于添加同样浓度的IBA。所有类型甜瓜材料在IAA 培养基上生根速度快，但根系较细，根量较少，不利于试管苗移栽成活。在不定芽生根的过程中也存在玻璃化现象，研究发现在生根培养基中添加3 g·L的活性炭能使培养中玻璃化苗比例下降且根系生长健壮（图2）。甜瓜再生植株最佳的生根培养基为MS+0.1 mg·LIBA+3 g·L活性炭。

3 讨论与结论

合适的激素种类和浓度配比是影响甜瓜再生效率的关键因素，首先表现在对不定芽的诱导上。6-BA 是诱导出不定芽的必需激素。IAA 对不定芽诱导影响较小，但合适配比的6-BA 与IAA 共同使用可以提高不定芽诱导率。以往的甜瓜再生体系研究中，其激素种类和浓度配比因甜瓜品种差异而有所不同。笔者在本试验中以具有高再生能力的甜瓜材料BU-21/3（var）和研究甜瓜再生体系常用的Védrantais（var）为对照，对比了甜瓜自交材料在含有不同激素浓度配比培养基上的再生效率，以筛选适用于不同类型甜瓜再生体系。发现适当质量浓度的6-BA（1.0 mg·L）对甜瓜不定芽的诱导有促进作用；6-BA 质量浓度过高（2.0 mg·L）不但不利于诱导不定芽，而且会再生出很多畸形芽，玻璃化严重，难以发育成正常植株。本试验中所用的不同类型8个甜瓜材料中，除M250 外，其他材料在MS+6-BA 1.0 mg·L上的不定芽诱导率最高，M250 在添加0.2 mg·LIAA 的培养基上不定芽诱导率最高，其他类型甜瓜在添加IAA 后反而会使诱导率降低，这可能是由于外植体内含有内源生长素，内源生长素含量高的品种在组培过程中添加IAA，会抑制不定芽的诱导。在相同培养条件下，不同基因型材料诱导率存在差异，薄皮甜瓜的再生能力高于厚皮类型和厚薄皮类型。

影响甜瓜不定芽诱导率的另一重要因素是外植体苗龄，本试验中所用的不同基因型甜瓜子叶均在3 d 苗龄时表现出最高的诱导效率。在以往的研究中，针对不同品种甜瓜最佳苗龄范围从2～6 d 不等，苗龄增大后，不定芽诱导率迅速下降，超过10 d苗龄的甜瓜子叶几乎不能诱导出不定芽。这可能与甜瓜子叶的内源激素有关，苗龄小的子叶内源激素水平较高，细胞全能性较好，与外源激素协同作用有利于不定芽高效诱导。

在植物组织培养生根过程中常用的激素有萘乙酸（NAA）、IBA 和IAA，不同激素对甜瓜不定芽的生根影响不同。有研究表明NAA 无论浓度高低都对甜瓜品种生根诱导存在抑制作用。故而本试验中并未设置NAA 浓度条件。低浓度的IBA 和IAA，对甜瓜的生根诱导有一定的促进作用。当IAA 浓度较高时容易诱导愈伤组织的形成，使根的形成受到抑制。笔者的研究显示，M2、M32 和M265 的不定芽在添加0.1 mg·LIBA的MS 培养基上生根率最高，且根系生长状态良好。添加IAA 的培养基生根率低，主根少且细，不利于后续再生苗移栽成活，添加IBA 生根状态明显好于添加IAA 的培养基。

笔者在本试验中通过对不同类型甜瓜再生体系进行系统优化，发现3 d 苗龄的甜瓜子叶最适合进行不定芽的诱导，并且在含有1.0 mg·L6-BA 的MS 培养基上不定芽诱导率较高。不定芽在MS+0.1 mg·L6-BA+0.05 mg·LIAA 培养基上伸长状态最好，在含有0.1 mg·LIBA 和3 g·L活性炭的培养基上生根最优。笔者在本试验中建立的适合不同基因型甜瓜的高效再生体系，为后续通过遗传转化进行甜瓜种质定向改良奠定了基础。