miR-589-3p靶向DSPP基因对口腔鳞状细胞癌肿瘤干细胞的调控作用①

游东乐 全海薇 全海英 （吉林医药学院附属医院口腔科，吉林 132000）

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）作为口腔颌面恶性肿瘤，严重影响人们生活质量并危及健康。由于受到面部生理功能以及结构特殊性等因素的影响，OSCC 也较容易发生远处转移和术后复发等情况［1］。肿瘤干细胞学说近年来越来越受关注，干细胞并非一种功能性概念，而是指在肿瘤中具有干细胞属性以及能力的部分细胞，明确干细胞作用的相关机制对于了解肿瘤的发生、进展以及耐药性等十分重要［2］。

牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）在种类上属于细胞外基质蛋白，其不仅在成牙本质中高表达，也存在于骨及非矿化组织中，DSPP 的突变会引起牙本质发育不良等［3］。近年来DSPP在口腔癌中的作用也不断被发现，如有研究证实该基因的沉默能够抑制口腔癌细胞株的关键致瘤活性［4］。另外也有研究证实DSPP 能够与基质金属蛋白酶20 相互作用，同时沉默DSPP 能够抑制口腔癌细胞干细胞标志物的表达［5］。miR-589 被发现在多种癌症中发挥致癌或者抑癌因子作用，如miR-589 能够通过调控LIFR-PI3K/AKT-cJun 通路进而促进胃癌的侵袭性［6］。另外也有研究表明其在肝癌中能够抑制肝癌干细胞标志物的表达［7］。但是对于其是否参与口腔相关癌症目前尚没有充足证据证明。本研究从肿瘤干细胞角度出发，探究miR-589-3p/DSPP在OSCC中的作用并探究其具体作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 EDTA 溶液（PB180320）、胰蛋白酶（9002-07-7）购自上海雅心生物技术有限公司；CD44（130-110-293）和 CD133（130-050-801）免疫磁珠均购自德国美天旎；转染用载体购自Invitrogen；Buffer溶液（EHJSW-023512）购自厦门慧嘉；流式细胞仪（CytoFLEX S）购自Beckman coulter；Lipofectamin 2000（11668027）购自Invitrogen；细胞转染载体购自上海吉凯基因；双荧光素酶报告基因试剂盒（E1910）购自 Promega；Trizol（15596-018）试剂盒、MTT 溶液（M1025）、Transwell 试剂盒（3413）、凋亡检测试剂盒（CA1020-20T）购自北京索莱宝；焦炭酸二乙酯（1609-47-8）购自上海吉至生化科技有限公司；紫外-可见光分光光度计（UV-1500）购自上海美析仪器有限公司；qRT-PCR 基因检测试剂盒（QPG-023）购自苏州吉玛基因；酶标仪（Thermo MK3）购自上海赛默生物；RPMI1640培养基（PM150110）购自武汉普诺赛；流式细胞仪（FACSCalibur）购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 组织样本收集 收集2018 年2 月至2019 年7 月收治于吉林医药学院附属医院口腔科的48 例OSCC 患者组织标本。男32 例、女16 例，平均年龄（60.2±9.7）岁。患者均行原位病灶切除或颈淋巴清扫术且术前未接受任何放化疗等质量措施，术后进行随访。同时收集同期于本院接受治疗的29 例口腔黏膜良性肿物患者的口腔黏膜上皮组织作为对照，男18 例、女11 例，平均年龄（59.5±10.3）岁。所有切除标本均置于液氮迅速冷冻，之后保存于-80℃环境。本研究符合赫尔辛基宣言，经本院伦理委员会审批同意且经所有患者知情同意。

1.2.2 细胞培养 将人OSCC 细胞置于RPMI1640培养液中并于37℃、5%CO2环境下培养。细胞生长密度约80%时使用含0.02%EDTA 和0.25%胰蛋白酶的消化液消化细胞并传代培养。

1.2.3 免疫磁珠技术分选OSCC 肿瘤干细胞 胰酶消化OSCC 细胞后加入血清终止消化，1 200 r/min离心5 min，离心半径20 cm，去上清后加入Buffer溶液和CD44/CD133免疫磁珠，4℃孵育10 min，1 200 r/min离心10 min 后去上清，Buffer 溶液重悬细胞，将分选架和磁场连接后将CD44/CD133 置于磁场，Buffer 溶液冲洗分选柱，加入细胞悬液后再次冲洗，分选柱脱离磁场后收集标记细胞，离心后接种于培养瓶。胰酶消化分选后的细胞，1 000 r/min 离心5 min 去上清，PBS 溶液冲洗。细胞计数后分两组，一组加入PBS 溶液和 5 μl 的 CD44/CD133 抗体，另一组加入PBS溶液和CD44/CD133同型对照。4℃孵育30 min后离心去上清，PBS 冲洗，流式细胞仪检测CD44+和CD133+细胞纯度。

1.2.4 细胞分组与转染 OSCC 肿瘤干细胞分为：mimics control 组（转染miR-589-3p 模拟物对照）、mimics miR-589-3p 组（转染miR-589-3p 模拟物）、inhibitors control 组（转染miR-589-3p 抑制物对照）、inhibitors miR-589-3p 组（转染miR-589-3p 抑制物）、mimics miR-589-3p+pcDNA-DSPP（共转染miR-589-3p模拟物和DSPP）。细胞转染步骤依据lipofectamin 2000说明书进行。

1.2.5 双荧光素酶验证miR-589-3p 与DSPP 的靶向关系 借助Targetscan 在线预测网站（http：//www. targetscan. org/mamm_31/）预测 miR-589-3p 与DSPP 之间的结合位点。之后通过双荧光素酶报告实验验证二者的靶向关系，实验步骤依据双荧光素酶报告基因试剂盒说明书进行，化学发光检测仪检测荧光素酶活性。

1.2.6 qRT-PCR 检测 依据Trizol 试剂盒说明提取细胞中总RNA，之后使用DEPC 处理的超纯水溶解RNA，紫外-可见光分光光度计测定吸光度值进而测定总RNA 浓度。借助qRT-PCR 基因检测试剂盒一步法完成RT 和PCR 反应，反应条件均依据试剂盒说明书完成。miR-589-3p 以U6 为内参，DSPP以GAPDH 作为内参，引物序列见表1。本方法同样适用于组织实验。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

1.2.7 Western blot RIPA 裂解液裂解细胞，然后将细胞收集于 EP 管，4℃、2 000 r/min 离心 30 min，BCA 试剂盒测定蛋白浓度，行SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，将蛋白转移至PVDF 膜，5%BSA 封闭1 h。洗膜，加入一抗兔抗人 DSPP、MMP2、N-cadherin、Vimentin。4℃孵育，TBST 冲洗，加入二抗山羊抗兔IgG。4℃孵育，TBST 冲洗，将化学发光液混匀后滴加至 PVDF 膜，ECL 显影，拍照，Image J 分析蛋白表达量。

1.2.8 MTT 法检测细胞增殖 细胞生长密度约80% 时以 1×106个/ml 的密度接种于 96 孔板，每孔20 μl，分别在24 h、48 h、72 h 时在细胞中加入20 μl的MTT溶液，浓度5 mg/ml，培养4 h后加入150 μl的DMSO 溶液。振荡混匀后将细胞置于酶标仪，检测490 nm处吸光度值并绘制细胞生长曲线。

1.2.9 Transwell 检测细胞侵袭情况 使用无血清RPMI1640培养基稀释ECM胶使其浓度为0.8 mg/ml，取 60 μl 加入 Transwell 小室上室，37℃ 孵育 8 h 后将50 μl浓度为1×106个/ml的细胞加入上室，下室加入趋化液，培养24 h后取出上室，吸除上室液体后，4%多聚甲醛固定，之后借助0.05%结晶紫溶液染色30 min。蒸馏水冲洗后显微镜下拍照，计算跨膜细胞数目。

1.2.10 流式细胞术检测细胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI 试剂盒检测细胞凋亡。首先胰酶消化细胞，调整细胞浓度为1×106个/ml 后以75%乙醇固定细胞，4℃ 过夜。1 500 r/min 离心 15 min，PBS 冲洗，缓冲液重悬细胞后加入5 μl Annexin V-FITC 以及10 μl PI，将二者混匀并且置于室温下反应15 min。使用流式细胞仪激发波长488 nm 和530 nm 对FITC进行检测，激发波长575 nm 对PI 进行检测，统计细胞凋亡。

1.3 统计学分析 采用SPSS21.0软件对数据进行统计学处理，所有符合正态分布的计量资料以表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。计数资料以百分比表示，采用Pearson 卡方检验进行检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 OSCC 组织中 miR-589-3p 表达降低、DSPP 表达增加 qRT-PCR 检测OSCC 和口腔良性肿物患者切除组织中 miR-589-3p 的表达和 DSPP 的 mRNA 表达，结果表明，相对于Control 组，OSCC 患者切除组织中miR-589-3p 表达被抑制而DSPP 表达增高（均P＜0.05）。同时，miR-589-3p 和DSPP 的表达呈负相关（r=-0.350 4，P=0.014 6）。见图1。

图1 Control 组和 OSCC 组组织中 miR-589-3p 和 DSPP mRNA表达情况Fig.1 Expression of miR-589-3p and DSPP mRNA in tissue of Control and OSCC group

2.2 miR-589-3p 靶向下调 DSPP 表达 Targetscan预测到miR-589-3p 与DSPP 存在结合位点。双荧光素酶报告实验结果显示，相对于共转染mimics control和DSPP-WT，共转染miR-589-3p模拟物与DSPP-WT的细胞中荧光素酶活性被显著抑制（P＜0.05）。同时，相对于 mimics control 组，mimics miR-589-3p 组中DSPP 表达被抑制（P＜0.05）；而相对于inhibitors control组，inhibitors miR-589-3p组中DSPP表达增强（P＜0.05）。结果表明 miR-589-3p 能够靶向抑制DSPP。见图2。

图2 miR-589-3p与DSPP的靶向关系验证Fig.2 Verification of targeting relationship between miR-589-3p and DSPP

2.3 OSCC 肿瘤干细胞分选鉴定结果 流式细胞术检测分选完成后的OSCC 细胞中的CD44 和CD133 表达，结果表明，CD133+和 CD44+细胞的纯度分别为91.02%及93.41%，表明分选后的细胞为OSCC肿瘤干细胞，能够用于后续实验。见图3。

图3 肿瘤干细胞分选结果Fig.3 Sorting results of cancer stem cells

2.4 过表达miR-589-3p 抑制OSCC 肿瘤干细胞增殖，促进细胞凋亡 检测各组增殖活力和凋亡情况，结果显示，相对于mimics control 组，mimics miR-589-3p 组细胞增殖活力被抑制，细胞凋亡增强（均P＜0.05）。而相对于 inhibitors control 组，inhibitors miR-589-3p 组细胞增殖活力被诱导而细胞凋亡减少（均P＜0.05）。见图4。

图4 各组细胞增殖活力和凋亡检测结果Fig.4 Cell proliferation and apoptosis results in each group

2.5 过表达miR-589-3p 抑制OSCC 肿瘤干细胞侵袭和上皮间质转化 对各组细胞侵袭和上皮间质转化相关因子进行检测，结果显示，相对于mimics control 组，mimics miR-589-3p 组细胞侵袭和上皮间质转化相关因子的表达被抑制（均P＜0.05）。而相对于 inhibitors control 组，inhibitors miR-589-3p 抑制物组细胞侵袭和上皮间质转化相关因子的表达减少（均P＜0.05）。见图5。

图5 各组细胞侵袭和上皮间质转化相关因子表达检测结果Fig.5 Results of cell invasion and epithelial-mesenchymal transition related factors expression in each group

2.6 DSPP 过表达逆转 mimics miR-589-3p 对 OSCC肿瘤干细胞增殖和凋亡的影响 对mimics control、mimics miR-589-3p以及mimics miR-589-3p+pcDNADSPP 组中细胞凋亡和增殖情况进行检测，结果显示，相对于mimics control组，mimics miR-589-3p组中凋亡增多而增殖活力被抑制（均P＜0.05）。mimics miR-589-3p+pcDNA-DSPP 组 和 mimics control 组 差异无统计学意义（均P＞0.05），表明DSPP 能够逆转miR-589-3p 过表达对OSCC 肿瘤干细胞增殖和凋亡的影响。见图6。

图6 各组细胞增殖和凋亡检测结果Fig.6 Results of cell proliferation and apoptosis in each group

2.7 DSPP 过表达逆转miR-589-3p 模拟物对OSCC肿瘤干细胞侵袭和上皮间质转化的影响 对mimics control、mimics miR-589-3p 以及 mimics miR-589-3p+pcDNA-DSPP 组中细胞侵袭和上皮间质转化情况进行检测，结果显示，相对于mimics control，mimics miR-589-3p组中细胞侵袭和上皮间质转化因子的表达被抑制（均P＜0.05）。mimics miR-589-3p+pcDNADSPP 组和mimics control 组差异无统计学意义（均P＞0.05），表明DSPP 能够逆转miR-589-3p 过表达对OSCC 肿瘤干细胞侵袭和上皮间质转化的影响。见图7。

图7 各组细胞侵袭和上皮间质转化相关因子表达检测结果Fig.7 Results of invasion and epithelial-mesenchymal transition related factors expression in each group

3 讨论

本研究从OSCC 肿瘤干细胞的角度出发，通过分选肿瘤干细胞并干预细胞中miR-589-3p 和DSPP的表达，发现miR-589-3p 能够抑制OSCC 肿瘤干细胞的增殖、侵袭、诱导细胞凋亡且该作用能够被DSPP逆转。

DSPP 为Sibling 家族的最大成员，其主要编码1 300 个氨基酸的蛋白质，在翻译后又分裂为2 个主要蛋白质即牙本质涎蛋白和牙本质磷蛋白，其在骨、牙齿等矿化组织和上皮细胞中均有表达［8-10］。近年来包括DSPP 在内的Sibling 家族成员被发现与胶质瘤、前列腺癌等多种癌症的增殖、迁移存在关联［11-12］。此外，GKOUVERIS 等［13］证实 DSPP 在口腔癌 中 具 有 致 瘤 性 。 SAXENA 等［14］发 现 DSPP 在MMP20 启动子区域大量富集且二者共同参与口腔癌的癌变。此外，DSPP 还能够对OSCC 肿瘤干细胞标志物进行影响［5］。本研究除进一步证实DSPP 在OSCC 患者组织中表达增强外还发现其表达与miR-589-3p 呈负相关。双荧光素酶报告实验进一步验证了二者之间的靶向关系，表明DSPP 可能受miR-589-3p的调控。

CD44+和CD133+细胞被发现在迁移、侵袭以及存活方面更具优势且对化疗具有更高抵抗力，也被认为是OSCC 肿瘤干细胞的标志物［15］。本研究借助磁珠分选技术成功分离出OSCC 肿瘤干细胞并干预其中miR-589-3p 和DSPP 的表达，结果证实过表达miR-589-3p 能够抑制OSCC 肿瘤干细胞的增殖、侵袭和上皮间质转化并诱导细胞凋亡。此外，同时转染 miR-589-3p 和 DSPP 后，miR-589-3p 对 OSCC 肿瘤干细胞的作用消失，表明DSPP 能够逆转miR-589-3p 的影响。上皮间质转化是癌症转移早期的关键步骤之一，主要表现为上皮细胞向间质细胞的转化［16-17］。越来越多的研究表明，上皮间质转化在口腔癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌等绝大多数癌症中均发挥重要作用［18-21］。本研究干预OSCC 肿瘤干细胞中miR-589-3p和DSPP的表达后，发现过表达miR-589-3p 能够抑制上皮间质转化相关因子的表达，且其作用可被DSPP 过表达逆转，即miR-589-3p 能够通过调控DSPP 的表达进而实现对OSCC 肿瘤干细胞生物学特性的影响。

综上所述，本研究结果表明，miR-589-3p在OSCC肿瘤干细胞调控中具有重要意义，其能够靶向DSPP进而抑制OSCC 肿瘤干细胞的增殖、侵袭等，对于明确OSCC 的机制具有重要意义。但本研究也有一定的局限性，如对体外实验的涉及不够，没有对细胞死亡的具体方式进行探讨等，本课题组将会在今后的研究中不断完善。