205例羊水细胞嵌合体的产前诊断结果分析

赵小秋 崔婉婷

羊水细胞嵌合体是指在同一份羊水标本中同时发现两种及两种以上核型，是产前诊断过程中一种常见结果。按照目前通用国际标准，可将羊水细胞嵌合体分为三个级别：Ⅰ级：仅在一个培养瓶内发现一个异常核型，此种情况大多数均为人为因素造成的假性嵌合；Ⅱ级：仅在一个培养瓶内发现两个及两个以上异常核型，该情况往往需结合其他培养瓶培养结果或其它检查进行判定，而且大多数情况也均为假性嵌合；Ⅲ级：在两个或两个以上的培养瓶内均发现同样的异常核型，该情况大多数为胎儿的真性嵌合[1]。染色体嵌合体真伪的判定及针对该结果的遗传咨询在产前诊断中至关重要，是决定妊娠结局的重要依据。目前针对产前诊断嵌合体结果的遗传咨询，尤其是有关染色体嵌合体的致病性的研究仍需大量病例的积累。本研究将针对205例羊水细胞嵌合体的产前诊断结果及妊娠结局进行分析，以期为产前诊断结果中染色体嵌合的相关解释提供参考。

对象与方法

一、研究对象

2018年1月至2019年11月中国医科大学附属盛京医院临床遗传科205例羊水细胞嵌合体核型结果。

二、方法：

1.研究方法：对羊水细胞核型结果进行回顾性分析，查找其核型复查结果和CNV-seq (copy number variations sequencing)检测结果；并对其中部分病例进行妊娠结局的回访，内容包括孕妇是否选择终止妊娠；若选择继续妊娠，胎儿出生后表型是否正常。

2. 诊断标准：本实验室羊水核型计数和诊断标准参照卫生部《2010年胎儿染色体异常的细胞遗传学产前诊断计数标准》。I级嵌合体(level I)：异常核型只出现在来自单个培养瓶的单个核型(single cell single flask, SC)；Ⅱ级嵌合体(level Ⅱ)：在同一培养瓶中检出两个或两个以上相同的异常核型 (multiple cells single flask, MC)；Ⅲ级嵌合体(level Ⅲ)：在两个或两个以上培养瓶中，检出两个或两个以上相同的异常核型。

3.统计学分析：将嵌合体结果输入EXCEL 2013表格建立数据库，分类后进行计数，计数资料用构成比和率表示。

结 果

1. 嵌合体发生率

本研究对7225例羊水细胞核型结果进行回顾，共发现205例嵌合体，其发生率为2.8%。

2.嵌合体分类

将205例嵌合体分为以下五类：(1)常染色体结构异常嵌合；(2)性染色体结构异常嵌合；(3)标记染色体嵌合；(4)常染色体数目异常嵌合；(5)性染色体数目异常嵌合。将每一类嵌合体按级别分类统计，并回顾其核型复查结果和CNV-seq检测结果(表1)。在205例嵌合体中，Ⅰ级嵌合为153例，占比最多(74.6%)；Ⅲ级嵌合为34例，占比16.6%；Ⅱ级嵌合为18例，占比最少(8.8%)。Ⅰ级嵌合结果中，大多数为常染色体数目嵌合(102例)，9例常染色体结构异常嵌合均为Ⅰ级嵌合；Ⅱ级嵌合结果中多数为性染色体数目异常嵌合(10例)，其次为染色体数目异常嵌合(7例)；Ⅲ级嵌合结果中，大多数为性染色体数目异常嵌合(25例)，其次为常染色体数目异常嵌合(8例)。

表1 205例嵌合体遗传学检查结果

3. 核型分析结果

在205例病例中，共有20例患者选择重新采取羊水或脐血标本进行核型分析。其中14例Ⅰ级和3例Ⅱ级嵌合病例的核型复查结果为正常核型；1例Ⅱ级常染色体数目嵌合病例(47,XN,+9[2](MC)/46,XN[49])复查结果为Ⅲ级嵌合(47,XN,+9[5]/46,XN[40])；2例Ⅲ级性染色体数目嵌合病例(45,X[2]/46,XY[28]和46,XX[2]/46,XY[48])复查后均为正常核型，未显示嵌合。

4. CNV-seq检测

在205例病例中，有76例孕妇选择CNV-seq检测。其中，CNV-seq在53例Ⅰ级嵌合病例中均未检测到嵌合。将23例Ⅱ级和Ⅲ级嵌合病例的核型结果与其CNV-seq检测结果进行对比(表2)，发现9例CNV-seq检测到的嵌合比例与核型嵌合比例不能完全一致；在3例Ⅲ级嵌合病例中，CNV-seq检测到的性染色体异常嵌合类型与核型结果不完全一致；6例Ⅱ级嵌合病例及5例Ⅲ级性染色体异常嵌合的CNV-seq检测结果未显示嵌合。

表2 羊水细胞Ⅱ级和Ⅲ级嵌合核型结果与CNV-seq结果比对

5. 妊娠结局随访

对Ⅱ级和Ⅲ级嵌合病例的妊娠结局进行回访(表3)，结果为在25例Ⅲ级性染色体异常嵌合核型中，18例孕妇选择引产，5例选择正常分娩，2例失访。有3例性染色体异常Ⅲ级嵌合的病例分别仅在两个培养瓶内计数到1个45,X细胞(45,X[2]/46,XN)，其后均分娩表型无异常的健康婴儿；1例核型为46,XX[2]/46,XY[48]，复查结果为46,XY，后正常分娩健康婴儿。另有1例核型为47,XYY[6]/46,XY[34]的孕妇选择正常分娩，新生儿表型无异常。10例Ⅱ级性染色体异常嵌合核型中，7例分娩表型无异常的健康婴儿；3例选择引产，依据为超声异常，而非染色体异常。在7例Ⅱ级常染色体嵌合核型中，1例核型结果为47,XN,+18[3](MC)/46,XN[84]的病例，其CNV-seq结果也提示18-三体嵌合；还有1例复查后为9号染色体三体嵌合且级别为Ⅲ级，此两例均选择引产；其余5例均分娩了健康婴儿。在8例Ⅲ级常染色体嵌合核型中，有6例嵌合型21-三体，1例嵌合型18-三体，1例为48,XXY,+18/47,XXY，以上8例病例均选择引产。

表3 羊水细胞Ⅱ级和Ⅲ级嵌合的妊娠结局

讨 论

染色体嵌合体是产前诊断中的常见现象。本研究显示嵌合体发生的比率为2.8%(205/7225)。其中Ⅰ级嵌合所占比例最大，即假性嵌合较多，可能与本实验室目前采取的传统的培养瓶法来收获羊水细胞有关。由于培养瓶法需手动将瓶壁上的细胞刮下，容易人为造成染色体断裂、易位等。在制片过程中不断地吹打液体，也有可能造成染色体数目异常的假性嵌合。而改进的原位培养法能较好的保持染色体的完整性，更好地来辨认染色体嵌合的真伪[2]。因此，必要时应改进实验方法，尽量减少假性嵌合给孕妇带来不必要的焦虑。

在所有染色体中，21、18和性染色体易形成非整倍体，且其异常胚胎存活的几率相对较高，其他染色体异常的胚胎基本都在早期流产，基本不能存活至孕中期[3]。故在本研究的Ⅲ级嵌合病例中，性染色体异常嵌合病例占比最高，常染色体嵌合核型中也绝大多数为21-三体嵌合，其次为18-三体，基本没有其他染色体三体。另外，性染色体嵌合形式存在多样，不仅有数目异常嵌合，也有结构异常嵌合，且绝大多数性染色体嵌合的核型中都包括45,X。这是由于在分裂错误产生的单体细胞中，X染色体单体是唯一可存活的细胞，而常染色体单体细胞基本没有存活的可能[4]，故在羊水细胞的嵌合体中只能发现X染色体单体。另有研究表明，X染色体单体往往需同时伴有X二体时个体才可存活，Turner综合征患者的某些组织中也通常会存在X染色体二体[5]。另外，染色体非整倍体与嵌合体的形成机制不尽相同。非整倍体的发生机制多为形成配子的减数分裂过程中染色体不分离，与孕妇高龄密切相关[6]。而嵌合型染色体数目异常多发生在处于受精卵有丝分裂后期的卵裂期，甚至可在囊胚形成期，且其多与有丝分裂后期迟滞相关[7,8]；而且有研究认为染色体嵌合体是受精卵分裂发育过程中的一种病理现象，与孕妇的年龄无关[9]。

在本研究中，因部分患者参考CNV-seq结果直接选择继续妊娠或引产，而且Ⅰ级和Ⅲ级嵌合的真伪基本可以判定，孕妇遗传咨询后也会据此直接选择妊娠结局，不愿承担风险再次取样，故孕妇自主选择采取脐血样品来进行复查的比例不高。通过对比核型结果和CNV-seq检测结果后发现，Ⅰ级嵌合的复查和CNV-seq检测结果均未提示嵌合体，也说明Ⅰ级嵌合多为假性嵌合，与国际公认观点基本保持一致。在Ⅱ级嵌合病例中，有1例核型为47,XN,+18[3](MC)/46,XN[84]的病例，其CNV-seq结果提示18-三体嵌合；另1例47,XN,+9[2](MC)/46,XN[49]复查后为47,XN,+9[5]/46,XN[40]。尽管常规观点认为Ⅱ级嵌合多为假性嵌合，但本研究中仍出现两个Ⅱ级嵌合病例为真性嵌合的病例，提示在Ⅱ级嵌合病例的遗传咨询时，应结合其它检查方法进行综合评估。

在Ⅲ级嵌合病例中，多数病例的胎儿核型和CNV-seq结果都有一定的差异。首先，两者检测到的嵌合比例不太一致，其原因一是可能由于核型结果中计数细胞太少，不足以代表胎儿核型全貌，而CNV-seq则是对胎儿羊水细胞DNA进行整体测序，两种方法所采取样本的量并不在一个量级水平上，所以嵌合比例会有所差异；另外一个原因是羊水核型所采用的标本为人工培养后的羊水细胞。羊水细胞来源多样，除胎儿呼吸道、泌尿道、消化道脱落的上皮细胞外，还包括羊膜腔上皮细胞[10]，有些细胞可能不适用于经历长时间的人工培养，所以培养后的羊水细胞和未培养的羊水细胞的嵌合比例会有区别[11]，之前所述的Ⅱ级嵌合病例为真性嵌合也可能与之有关。

本研究还发现在检测性染色体嵌合时，核型结果与CNV-seq结果的区别更大，除嵌合比例不同外，检测到染色体异常的类型也不一致，这可能与CNV-seq技术的原理有关。CNV-seq技术是通过对测序数据进行统计分析后得出染色体的拷贝数[12]，只能根据拷贝数判定出X染色体的异常比例，而无法判断其异常类型。更有甚者，如核型为45,X/47,XXX/46,XX的嵌合体，其CNV-seq结果中的X染色体的整体拷贝数与正常女性的拷贝数并无太大差异，其结果还是在2左右，不能显示出X染色体存在嵌合型异常。另外1例核型结果为45,X[39]/46,X,der(Y;Y;Y)(qter→p11.3::p11.3→q12::q11.2→qter)[4]，其CNV-seq结果并未提示嵌合体，且X、Y染色体拷贝数均为1(图1)。因此，由于技术的限制，CNV-seq可能会漏诊某些类型的性染色体异常嵌合，不能完全替代传统的核型检查，两者结合起来可提高染色体异常的检出率[13]。

图1 性染色体异常嵌合体的核型和CNV-seq结果

在产前诊断结果中有关嵌合体的遗传咨询时，一般认为，若常染色体三体嵌合，胎儿异常的风险较高，而性染色体异常嵌合有可能不会影响智力发育和表型。而且由于细胞分裂错误会发生在胚胎发育过程的不同时期，其产生的细胞系嵌合会存在于不同的组织和器官中，导致个体症状也不尽相同[9,14]，这时需把风险充分告知给孕妇，让其做知情选择。总之，在产前诊断过程中，应改进并采取多种实验方法来提高染色体嵌合体的诊断准确率[15]，并配合规范的遗传咨询建议，尽量为患者提供良好的产前诊断服务。