卵巢癌肿瘤干细胞及其标志物与卵巢癌靶向治疗的研究进展

关慧鑫 韩世愈

卵巢癌是目前全球范围内最致命的妇科肿瘤。每年诊断出约240 000例新的卵巢癌病例，其中140 000例患者死于该病[1]。5年总生存率低于45%，晚期卵巢癌患者降至25%[2]。经研究发现有以下3个因素导致卵巢癌的高致死率。首先，由于早期卵巢癌无明显临床症状，70%的病例在肿瘤已经扩散到腹腔时才被诊断出来[3]。其次，即使在初次减灭手术和以卡铂/紫杉醇为主的辅助化疗后，多数情况下诊断后的两年内，绝大多数晚期卵巢癌患者都会出现肿瘤复发[4]。第三，与原发肿瘤相比，复发性疾病常对常规化疗产生耐药性，导致治愈率非常低，并导致卵巢癌的高致死率。因此，卵巢癌已成为威胁现代女性健康的一大杀手。肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)是一种具有自我更新和分化能力的癌细胞亚群，被认为是肿瘤生成，进展，转移和复发的根源。近年来，随着对CSC的研究发现，它与卵巢癌的生成，侵袭转移及耐药复发有着显著的关系，尤其是卵巢癌干细胞标志物在卵巢癌的早期诊断及靶向治疗中开辟了新的天地。

一、CSC基本概念

1.CSC的发现和来源：CSC又叫做肿瘤起始细胞，占肿瘤细胞总数的0.01%～0.10%，具有无限的增殖潜能。Makino[5]于1959年发现肿瘤细胞可能来源于CSC，并且首次提出CSC假说。CSC假说认为，恶性肿瘤是由CSC经过前体细胞及成熟肿瘤细胞进一步分化而来。Lapidot[6]等人首次分离出了急性髓系白血病的致瘤性干细胞群体，发现其中的单个细胞可使小鼠重新引发白血病，由此证实了CSC的存在。CSC的发现和探究开启了人类对恶性肿瘤来源，转移，治疗，复发乃至耐药机理的疯狂探索，近而为人类尽快攻克癌症难题开启了一扇希望之门。

2.CSC特征：人们研究发现CSC像大多数成体干细胞一样，有着“干细胞”样特征。成体干细胞即指存在于已分化组织中的未分化细胞，其具有自我更新和分化潜能。而CSC可概括为如下三个特征(1)可使肿瘤的致瘤性增加。(2)无限的自我更新潜能，一般在多次传代后仍然具有致瘤性。(3)多能性，即CSC注入后形成的肿瘤表面可有其特征性的肿瘤标志物[7]。

二、卵巢癌干细胞(ovarian cancer stem cells，OCSC)基本概念

1.OCSC的发现和来源：2005年，Bapat等人[8]从晚期卵巢癌患者腹水中分离并获得干细胞样克隆,同时用低密度培养法获得了19个永生化的克隆,其中有2个克隆在体外软琼脂培养基中培养形成了悬浮生长的细胞球,并且具有CSC的特性，这是OCSC的首次发现。Flesken-Nikitin等人[9]研究结果显示，OCSC可能来源于卵巢表面上皮细胞，输卵管上皮细胞及周围组织中的多能干细胞。女性每次月经周期，卵巢周期性排卵活动中，排卵过程诱导卵巢表面上皮细胞周期性破裂和再生修复，当卵巢表面上皮细胞DNA损伤无法及时修复或修复失败时，可转化为CSC。

2.OCSC与卵巢癌：有研究显示，干细胞基因在卵巢表面上皮及输卵管上皮中均有显著表达[10]。这可能是卵巢癌发生的根源所在。女性月经周期卵巢规律性排卵过程中，卵巢上皮细胞不断重复损伤-修复过程，卵巢中的干细胞不断增生分化，这一动态过程中若受到炎症刺激、间质内皮转化，缺氧等各种肿瘤微环境改变的影响，则有可能导致卵巢干细胞持续增生，停止分化从而引发癌变[11]。同时，CSC具有无限自我更新和增殖分化的能力，其同样具备转化成为OCSC，进而导致卵巢癌的发生。

三、卵巢癌干细胞标志物

随着对卵巢癌的深入了解发现，卵巢癌干细胞表面有一些特异性的表面标志物，与肿瘤的无限增殖，浸润，转移乃至耐药及复发密切相关。研究特异性卵巢癌干细胞标志物是攻克肿瘤难关的关键所在。卵巢癌特异性的肿瘤干细胞标志物尚在逐步探索中，现有以下肿瘤干细胞标志物相对较为成熟。

1.CD133(prominin-1)：是一种跨膜糖蛋白，最初被证明是造血干细胞和祖细胞的特异性标记[12]。 同时在成人的多种类型的干细胞中被发现，并被认为可以抑制细胞分化[13]。在卵巢癌中，CD133的表达首先由Ferradina等人[14-15]发现，他们依据抗原表位的不同将其定义为CD133-1和CD133-2 ，同时发现其在卵巢肿瘤组织中的表达高于正常卵巢组织及卵巢良性肿瘤。且CD133+卵巢癌细胞显示出比CD133-细胞更高的克隆形成能力和增殖潜能[14]。有实验证明，将原代培养的卵巢癌细胞中CD133+细胞及CD133-细胞同时注入重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency disease，SCID)小鼠体内，发现CD133+细胞逐渐产生肿瘤特性，且表现出更强的化疗抗性。同样，Curley等人[16]研究表明，从原发卵巢癌中分离的CD133 +细胞能够使SCID小鼠产生肿瘤。这一系列证据表明CD133是一种肿瘤干细胞标志物，与卵巢癌的发生发展密切相关。CD133是历史上第一个被研究的肿瘤干细胞标志物，并且它的研究开启了人类对于卵巢癌的进一步实质性了解，但其具体作用机制仍然在探索中。

2.CD44：是一种完整的膜糖蛋白，是透明质酸(HA)的主要受体。它参与特定的细胞-细胞和细胞-细胞外基质的相互作用，其存在往往与化疗耐药性与肿瘤侵袭性相关[17]，被认为是卵巢癌潜在的肿瘤干细胞标志物。HA和CD44之间的相互作用触发了多种信号转导途径，并参与细胞增殖分化，血管生成与转移等多种活动。有趣的是，HA的结合刺激Nanog的CD44募集，Nanog是一种调节多种肿瘤干细胞样特征和化学耐药性的转录因子。 与CD44的相互作用诱导Nanog的激活和核易位，导致其癌基因的表达[18]。HA-CD44相互作用还促进质膜上信号结构域的形成，从而激活受体酪氨酸激酶介导的信号传导，如EGFR-Ras-ERK途径[19]，从而有助于肿瘤干细胞的增殖和侵袭。在有关卵巢癌的研究中发现，复发性卵巢癌与原发性相比，CD44表达水平更高[20]，且经过紫杉醇治疗后的复发肿瘤中也存在CD44的过表达，可见CD44与化疗耐药相关。同时研究表明，CD44的表达与患者无进展生存期及总生存期下降密切相关。特别是在卵巢癌中，研究发现CD44v6在卵巢癌腹膜转移中的表达上调，更重要的是，一部分CD44v6+肿瘤细胞显示出转移启动活性[21]。Zhou等人进一步研究发现CD44v6与卵巢癌的组织学分级，FIGO分期及5年生存率相关，提示CD44v6是预后不良的重要标志物[22]，同样Wang 等人[23]经研究发现CD44v6的过表达与浆液性卵巢癌的不良预后密切相关。综上所述，CD44被认为是卵巢癌的潜在肿瘤干细胞标志物是无可非议的。

3.CD47：是一种跨膜蛋白，是信号调节蛋白-α(SIRP-α)的配体，可分泌基质细胞蛋白凝血酶敏感蛋白-1[24]。 CD47是所有人类癌症中过表达的表面标志物，因为它与SIRP结合，向吞噬细胞发送“别攻击我”信号，抑制巨噬细胞介导的破坏，逃避免疫监视，这是CSC导致肿瘤发生的最重要步骤[25]。CD47的上调是肿瘤干细胞用于逃过免疫系统的一种重要的机制，其在癌症复发中起关键作用[26]。在实体肿瘤中，如卵巢癌，乳腺癌，结肠癌，膀胱癌，前列腺癌，胶质母细胞瘤和肝细胞癌中，CD47的表达增加也是预后不良的一个独立危险因素[25]。同样有学者发现，高表达CD47与高级别浆液性卵巢癌患者的不良预后相关[27]。

4.CD24：热稳定抗原CD24(一种糖基磷脂酰肌醇锚定的膜糖蛋白)已被广泛用作各种癌症类型中CSC的标志物，包括结直肠癌，胰腺癌，鼻咽癌及卵巢癌。不同实验室结果均表明CD24有望成为卵巢癌肿瘤干细胞的标志物。Burgos-Ojeda[28]等人，使用基于组织特异性缺失Trp53，Pten和Apc的卵巢癌小鼠模型，鉴定得出CD24+细胞为肿瘤起始细胞。Gao等人通过进一步研究，从卵巢癌标本中分离出CD24+细胞亚群，并证明该细胞亚群有较高的干细胞相关基因表达，更重要的是，它具有较高的致瘤能力[29]。Li等人通过对已建立的卵巢癌细胞系进行研究，不仅表明CD24在成球细胞表达中增加，而且进一步验证敲除CD24将影响其克服失巢凋亡及球形成能力[30]。同时有研究显示，在卵巢癌腹水中的肿瘤细胞表达的CD24水平高于实体肿瘤，这被认为是CSC特征富集的标志[31]。Moulla等人[32]进一步通过研究发现CD24的过表达与卵巢癌的肿瘤分级及患者的不良预后密切相关，这表明CD24可作为潜在的卵巢癌干细胞标志物，为卵巢癌的诊断，治疗及预后带来希望。

5.乙醛脱氢酶(ALDH)：是促进醛底物氧化成相应羧酸的酶。在ALDH家族中，ALDH1亚群在正常和CSC中特别活跃。特别是在ALDH1同工酶(ALDH1A1、ALDH1A2和ALDH1A3)中，ALDH1A1在CSC中有显著表达[33]。ALDH1可以作为肿瘤细胞抵抗化学治疗剂的分子泵，从而增加肿瘤的耐药性。来自Condello等人的研究，提示OCSC中的ALDH1A1在转录水平上受到Wnt/β-catenin途径的调节，并显示小分子ALDH1A1抑制剂消除了球形成能力，表明ALDH1A1是潜在的治疗靶点[34]。进一步研究发现在卵巢癌细胞系中敲除ALDH1A1恢复了卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性[35]，从而明确ALDH1A1与卵巢癌的化疗耐药性相关。此外，敬宏等人研究结果显示 ，ALDH1在卵巢癌组织中存在过表达，且表达水平与卵巢癌的临床分期及淋巴结是否转移密切相关，同时，ALDH1的表达与CD117、CD133的表达存在交叉重叠，提示ALDH1有可能成为潜在的卵巢癌干细胞标志物[36]。

6. CD117：又被称为c-kit，是一种参与细胞信号转导的III型受体酪氨酸激酶。它参与细胞的各种活动，包括细胞凋亡，细胞分化，增殖和细胞粘附[37]。有文献报道显示，在卵巢癌中CD117的表达明显增高[8]。Luo等人进一步研究发现CD117+卵巢癌细胞比CD117-在异种移植模型中更具有自我更新、分化和肿瘤再生的能力[38]。还有报道指出，卵巢CSC中CD117是引起顺铂/紫杉醇类化疗耐药的根源所在[39]。因此，CD117被认为是卵巢癌肿瘤干细胞的潜在标志物，抑制CD117的表达可能成为未来治疗卵巢癌一种新的有效方法。

四、卵巢癌的靶向治疗

卵巢癌以高致死率，高复发率，高耐药率居女性妇科肿瘤之首。化疗等辅助治疗是除手术之外治疗卵巢癌的主要方法。但其化疗缓解后的再复发给患者带来了巨大的困扰。少数耐药的肿瘤干细胞被认为是卵巢癌复发的根源所在。因此，针对卵巢癌肿瘤干细胞标志物的靶向治疗开启了卵巢癌治疗的新方向。

1.CD133作为靶点：Baba等人[40]研究发现CD133的表达受表观遗传修饰的直接调控，包括DNA甲基化和组蛋白修饰。 对卵巢癌细胞系用 DNA甲基化酶抑制剂地西他宾处理，发现CD133mRNA转录水平升高，CD133阳性细胞增多，说明可以利用表观遗传学方法对这群细胞进行监测或调控，促进肿瘤干细胞的分化，极大可能减少卵巢癌的复发，为卵巢癌的治疗开辟新的途径。有实验表明，将小鼠体内繁殖的抗人CD133抗体与细胞毒性药物MMAF结合，二者协同作用通过诱导细胞凋亡来抑制癌细胞的生长[41]。

2.CD44作为靶点：CD44是一种与HA结合的表面粘附分子，与肿瘤的浸润和转移有关。目前已经开发了几种针对CD44v6亚型的抗体，并且已经用于头颈部鳞状细胞癌患者的I期临床试验中[42]。同时HA与紫杉醇的生物结合物正被研究以增强细胞毒性药物选择性地进入表达CD44的卵巢癌细胞，并用于卵巢癌的腹膜内治疗[43]。

3.CD47作为靶点：在各种异种移植肿瘤模型中，人CD47阻断单克隆抗体已被证明对多种肿瘤有很好的疗效，包括白血病，淋巴瘤，膀胱癌及乳腺癌等[44]。研究显示通过阻断CD47-SIRPα通路可治疗各种CD47高表达的肿瘤，是肿瘤靶向治疗的潜在靶点。Hongrapipat等人[45]研究发现，在卵巢癌OVCAR-3细胞系中，将化疗药物及光动力疗法药物与抗CD47抗体 Fab′结合可使卵巢癌细胞对药物的反应性提高，为CD47在卵巢癌中的靶向治疗奠定了基础，因此CD47有望成为卵巢癌靶向治疗的潜在靶点。

4.CD24作为靶点：CD24是粘蛋白型粘附分子，与肿瘤转移能力相关[46]。有研究证实抗CD24抗体SWA11使肺癌细胞A549和胰腺癌细胞BxPC3的异种移植小鼠的肿瘤体积明显减小[47]。2009年，Su等人成功应用短发夹RNA(shRNA)来敲低CD24的表达，CD24的敲低促进了卵巢癌细胞系SKOV3的细胞凋亡，从而降低了细胞增殖活力，同时抑制了卵巢癌小鼠的肿瘤生长[48]。 因此，有效抑制CD24可能成为卵巢癌靶向治疗的有效方法之一。

5.ALDH作为靶点：ALDH可保护细胞免受致癌物质的侵害[49]。有实验表明，在小鼠卵巢癌模型中敲低ALDH1A1的表达可恢复卵巢癌细胞系的化疗敏感性[35]。因此，ALDH的抑制剂也被认为是一种新的靶向治疗方法。例如，双硫仑，一种ALDH抑制剂，与吉西他滨联合应用对多形性胶质母细胞瘤具有协同的细胞毒作用[50]。此外，双硫仑不仅可以优先杀死ALDH+的卵巢癌干细胞，并且可与顺铂协同应用用于卵巢癌的治疗。

6.CD117作为靶点：伊马替尼是一种有效的CD117(c-KIT)特异性抑制剂，已用于多种类型癌症的临床试验中，其中包括卵巢癌[51]。 Patel等人[52]研究发现，甲磺酸伊马替尼在卵巢癌A2780细胞系中参与复杂的细胞活动，包括细胞代谢，细胞周期，细胞增殖，细胞凋亡和细胞信号转导。因此，CD117可能是酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼的完美治疗靶点，可能为未来卵巢癌的靶向治疗带来新的希望。

五、小结与展望

既往的相关研究中，有关卵巢癌肿瘤干细胞标志物的研究取得了不小的进展。在有关专家的共同努力之下，成功分离并培养出了肿瘤干细胞，并筛选出了潜在的可能成为卵巢癌肿瘤干细胞的标志物。但这些远远不够，其具体作用机制及靶向治疗的研究仍需进一步探究。首要任务是继续寻找并筛选出卵巢癌的特异性肿瘤干细胞标志物，近而更早期准确的发现肿瘤，从而更精准的实现靶向治疗，为卵巢癌患者的精准治疗开辟新的途径。