自噬在肺动脉高压疾病中的作用及研究进展

张宁宁，陈永锋，康品方，王洪巨

肺动脉高压(pulmonary hypertension，PH)是指肺动脉压力升高超过一定界值(海平面静息状态下，右心导管测量肺动脉平均压力mPAP≥25 mmHg)的一种血流动力学和病理生理状态，可导致右心衰竭甚至死亡，临床病死率高、预后差。第六届世界肺动高压会议[1]更新了PH的定义，将毛细血管前肺动脉高压定义为mPAP>20 mmHg，肺动脉楔压(PAWP)<15 mmHg，肺血管重构(PVR)>3WU，为临床早期治疗PH提供重要依据。与此同时，该会议在保留原有诊断分类的基础上对疾病分类进行了简化，依据不同病因将PH分为五大类：(1)动脉性肺动脉高压(PAH)，包括遗传性、特发性、药物/毒物所致肺动脉高压等；(2)左心疾病所致肺高血压；(3)慢性肺部疾病/缺氧所致肺高血压，包括慢性阻塞性/限制性肺疾病、缺氧所致肺动脉高压等；(4)肺动脉阻塞所致肺高血压，包括慢性血栓栓塞性肺动脉高压(CTEPH)、其他肺动脉阻塞性病变所致肺动脉高压；(5)未知因素所致肺高血压，包括溶血性/系统性疾病所致肺动脉高压等。尽管肺动脉高压分类不同，但是共有的特征性病变是肺血管重构(PVR)，而肺血管内皮细胞(PAEC)功能障碍和肺动脉平滑肌细胞(PASMC)异常增殖对PVR发挥重要作用[2]。

自噬是一种细胞内分解代谢和再循环的过程，通过溶酶体降解错误折叠的蛋白质、受损的细胞器和病原体，并重新回收这些胞内容物，是一种促细胞生存机制。基础水平的自噬有助于维持细胞内环境稳定，而过度激活自噬则导致自噬性细胞死亡引发疾病[3]。过去关于自噬在肺部疾病中的研究主要在哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺气肿、特发性肺纤维化、支气管扩张症，而对于肺动脉高压的研究相对缺乏。近几年，研究[4-5]发现自噬在PH疾病方面的作用突出，自噬通过调节PAEC和PASMC的增殖、凋亡、炎性因子分泌等途径，影响PH的病理过程，自噬蛋白在这一过程中发挥重要的调节作用。本文主要查阅最近5年文献，对主要的自噬蛋白在PH中的作用作一综述。

1 自噬蛋白

1.1 骨形成蛋白II型受体(BMPR2) BMPR2是转化生长因子β(TGF-β)受体超家族成员骨形成蛋白(BMP)的受体蛋白，对促进胚胎发生及发育、维持成人组织内环境稳定至关重要。此外，BMPR2对于维持肺动脉内皮细胞的屏障功能也起重要作用，BMPR2缺乏会增加内皮炎症反应，导致肺血管重塑，促进肺动脉高压发生[6]。由于BMPR2基因突变与PH之间存在强烈相关性，现已被确定是遗传性肺动脉高压的主要原因[7]，流行病学研究[8]表明超过70%的家族性肺动脉高压患者和20%特发性肺动脉高压患者中发生BMPR2基因突变，BMPR2蛋白表达减少促进PH发生。一项关于PH患者BMPR2突变与生存率的meta分析[9]显示，BMPR2突变的患者可以发展为更严重的疾病，生存率下降。当BMPR2基因发生突变，BMPR2蛋白在细胞中表达减少，使受体下游功能丧失、信号传导减少，引起异常信号通路活动，导致内皮细胞过度生长和增殖，而上调BMPR2蛋白表达则能够改善PH，一项研究[10]对野生型和BMPR2杂合子缺失的小鼠进行骨髓移植，16周后以脂多糖刺激小鼠发生PH，野生型小鼠在接受BMPR2杂合子缺失小鼠的骨髓后，发生了肺动脉高压，而BMPR2杂合子缺失小鼠接受野生型小鼠的骨髓后则未发生肺动脉高压，表明骨髓移植能够改变BMPR2突变小鼠对PH的易感性，造血干细胞移植BMPR2可能是遗传性肺动脉高压的潜在治疗策略。Gomez-Puerto等研究[11]进一步发现BMPR2蛋白在PH患者中表达减少，使用自噬抑制剂后BMPR2表达升高，证明BMPR2通过自噬途径降解并导致PH，突出了自噬在PH中的关键作用。

1.2 微管相关蛋白1轻链3β(LC3B) 微管相关蛋白1轻链3(LC3)，是在双膜自噬体上表达的自噬蛋白。包括LC3A、LC3B、LC3C三个亚型，参与形成自噬小体。通常情况下，LC3B以LC3B-I的形式存在于细胞质中，可通过自身C-末端的蛋白水解酶裂解，与磷脂酰乙醇胺结合形成LC3B-II，组装在自噬体膜上，促进自噬体成熟。因此，LC3B-II是自噬激活的标志[12]。Lee等[13]在前人研究基础上首次证明在PH患者中发生自噬增强，LC3B是PH防御机制中的关键自噬蛋白，LC3B-II在PH重症患者的肺组织中表达上调，其机制通过减弱PASMC的增殖，产生对缺氧的适应，延缓了PH的疾病进展。实验以LC3B特异性siRNA转染PAEC和PASMC，使LC3B蛋白在这两种细胞中表达减少，在缺氧条件下，转染组的PAEC和PASMC增殖较非转染组明显。相反，过表达LC3B蛋白可减弱PAEC和PASMC增殖，表明LC3B在PH疾病进展过程中具有抗细胞增殖效应，从而发挥保护作用。Ye等[14]也证实了LC3B对PH的关键作用，在缺氧性肺动脉高压(HPH)大鼠的PASMC中加入胡椒碱后，LC3B-II/LC3B-I比值显著增加，PASMC增殖减弱，而加入氯喹后抑制PASMC自噬，PASMC增殖明显，LC3B-II/LC3B-I比值降低，他们认为胡椒碱能有效抑制PASMC增殖、降低肺动脉收缩压、降低右室肥厚、改善血管重构，是通过上调LC3B表达和增强自噬发挥治疗作用，提示上调LC3B的表达或许是治疗PH的一种可行方法。

1.3 选择性自噬接头蛋白1(SQSTM1/P62) 选择性自噬接头蛋白1(SQSTM1)也称P62，其分子量为62kDa，是一种多功能泛素化结合的接头蛋白，参与生物体内两种蛋白质降解途径，即自噬-溶酶体途径和泛素-蛋白酶体途径，二者相互作用，在正常情况下和应激期间对细胞存活起着关键作用[15]。P62是一种典型的自噬受体和多功能蛋白，位于整个细胞内，充当桥梁连接两种蛋白质降解途径，当蛋白酶体被抑制，产生蛋白毒性通过磷酸化P62激活自噬；当自噬活性下降，P62不能将受损蛋白质靶向至自噬溶酶体而积累，蛋白酶体底物向蛋白酶体传递延迟，损害泛素-蛋白酶体系统，使细胞清除能力受损[16-17]，因此，P62蛋白的表达水平与自噬水平呈负相关,P62蛋白表达下调表明自噬-溶酶体途径畅通。Mao等[18]利用缺氧构建大鼠PH模型，结果显示低氧后在肺动脉中P62蛋白表达显著下调，在PH大鼠肺组织中自噬水平增加而P62蛋白显著降低。另有文献[31]报道激活自噬使P62蛋白表达升高，因此，P62参与PH中的自噬有一定的研究价值，是可能的治疗靶点。

1.4 自噬关键分子酵母Atg6同系物(Beclin-1) Beclin-1基因，是酵母自噬相关基因Atg6的同源基因，其蛋白分子量约60kDa，含有BH3蛋白结构域，BH3蛋白属于抗凋亡因子Bcl2家族，可以介导Beclin-1与抗凋亡蛋白Bcl2/Bclxl相互作用，形成抑制自噬过程的复合体。只要Beclin1和Bcl2/Bclxl相互结合，就不能启动自噬过程。在饥饿、BH3结构域突变等条件下，Beclin 1-Bcl2/Bclxl复合体被解离，在解离后，Beclin 1参与形成自噬小体，招募各种自噬蛋白进入自噬前小体[19-20]。Teng等[21]使用3-甲基腺嘌呤和氯喹分别处理胎羊持续性PH的PAEC，结果表明抑制自噬后，PAEC凋亡减少、增殖明显，血管生成增加，而Beclin-1敲低则改善PAEC血管生成，提示Beclin-1通过增强自噬促进PH发生。而在另一个野百合碱(MCT)诱导的PH模型中，Feng等[22]观察到MCT组Beclin-1表达增加，LC3BII/LC3BI比值增加，右室收缩压升高和肺动脉管壁增厚，而MCT+紫杉醇干预组Beclin-1表达减少，LC3BII/LC3BI比值降低，右室收缩压降低和肺动脉管壁厚度降低，表明抑制Beclin-1表达，抑制自噬可以有效改善肺血管重塑。Ibrahim等[23]的报道也得出一致结论，关于抗肿瘤药物多西他赛能逆转肺血管重构、改善右心室纤维化，其机制是通过促进Beclin-1降解、抑制自噬起治疗PH作用。

1.5 一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK) 一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)是一种在哺乳动物中广泛表达的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物，对调节生物代谢和维持能量平衡起重要作用，自噬作为细胞的一种自我保护机制，也受到AMPK调控。AMPK分别通过正向调节自噬复合物(ULK1)、负向调控雷帕霉素靶蛋白(mTOR)诱导自噬过程[24]。AMPK激活自噬与自身亚基类型相关，它是由一个催化亚基(α1、α2)两个调节亚基β、γ组成，在PH中的作用主要与α1、α2亚型有关，AMPKα2缺失可加剧形成PH。Wang等[25]发现在缺氧条件下，AMPKα2基因敲除组小鼠右室收缩压升高、右心室肥厚明显，肺血管壁厚度增加、右心室/左心室+室间隔比值增加。此外，AMPKα2在抑制PASMC增殖中也发挥关键作用，AMPKα2特异性SiRNA转染PASMC后，转染组磷酸化mTOR表达增加、PASMC增殖明显，加入雷帕霉素后抑制mTOR表达，PASMC增殖减弱，证明敲除AMPKα2后丧失了对自噬的直接激活作用，并且间接解除对mTOR的抑制，导致自噬作用减弱、PASMC增殖不受控制。杜阿胖等[26]探索了二甲双胍治疗MCT诱导PH的机制，结果显示MCT-PH组大鼠肺动脉管腔狭窄和管壁增厚、自噬标志物LC3II/LC3I比值增加和Beclin1蛋白表达增加、肺组织P-AMPK/AMPK比值增加，经二甲双胍治疗后PASMC增生明显减少、肺动脉管壁变薄、管腔大小接近正常、上述自噬标志物表达明显增加，证实二甲双胍活化AMPK抑制MCT-PH的机制是促进PASMC自噬、抑制PAMSC增殖，改善肺血管重塑。这些结果提示增强AMPK表达、提高自噬活性可能是预防和治疗PH的新策略，也有相关文献[27]报道抑制AMPK活性能保护PH，AMPK在PH的作用存在一定争议。

1.6 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR) mTOR作为多种信号通路的下游信号蛋白，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可正性调节细胞增殖、生长、存活，在营养充足条件下，磷酸化的mTOR与ULK1在ser757位点结合，抑制ULK1-AMPK的相互作用，导致ULK1失活，最终抑制自噬[28]。研究[29]表明mTOR参与PASMC和PAEC的增殖、迁移、表型转换，引起肺血管重塑和持续性血管收缩，最终导致PH的发生，抑制mTOR对PH发挥保护作用。在另一HPH大鼠模型中，条件性诱导和敲除mTOR，结果显示mTOR表达水平显著降低，右室收缩压下降、右室肥厚程度降低，肺动脉壁管腔狭窄程度减小，肺血管重塑得到改善[30]。在另一项研究[31]以MCT诱导大鼠肺动脉高压，结果显示MCT干预2周组和4周组的右室肥厚程度增加，右室中磷酸化的mTOR蛋白表达水平显著下调，自噬标记物LC3-II/LC3-I比值显著增加，表明抑制mTOR蛋白表达、激活自噬可能是预防右室心肌肥大和功能障碍的重要靶点。

1.7 自噬相关蛋白(ATG7) ATG7在自噬中负责调节自噬小体组装，介导LC3酯化磷脂酰乙醇胺并与自噬相关蛋白ATG5/12结合，是自噬小泡延伸的关键蛋白,研究[32]表明ATG7促进自噬，对PH起防御和保护作用。Yang等[33]以HPH小鼠为模型，实验组敲除ATG7基因，小鼠超声显示敲除组小鼠较非敲除组更易发生PH和心功能不全，表明ATG7通过改善血管重构阻止PH，以ATG7特异性SiRNA转染PASMC后通过PP2A/4EBP-1/ELF-4E信号通路提高细胞内钙离子浓度，诱导PASMC从收缩表型向分泌型转变，导致PASMC增殖，过表达ATG7蛋白则减弱PASMC的增殖，表明ATG7蛋白表达减少造成的自噬活性下降促进血管重构并导致PH，ATG7具有保护和防御PH的作用。

此外，有文献[34]报道自噬蛋白ATG5可用来评估宫颈癌病情，其他文献[35]报道ATG9介导心肌细胞自噬从而改善心肌缺血，但在肺动脉高压方面尚缺乏研究，未来或能在更多的自噬蛋白相关研究中发现其对肺动脉高压的作用，本综述不作一一叙述。

2 展望

当前研究自噬相关蛋白在PH中的作用主要有两种方法：一，通过基因敲除办法或干扰RNA技术，观察目的蛋白表达下调后是否调节了自噬从而改善或促进PH的发展；二，使用目的蛋白调节剂激活或抑制其表达水平，通过增强或减弱自噬来研究其对PH的作用。自噬蛋白的表达对PH的研究带来便利，然而因蛋白种类众多，本文不能对每一种自噬相关蛋白进行概述，是不足之处。此外，虽然动物模型在一定程度上促进了自噬在PH中的研究，但是不能完全代表人体PH的组织学变化，由动物研究到临床应用仍是一个漫长、充满挑战的过程。