HSF1通过抑制中性粒细胞浸润减轻LPS诱导的小鼠急性肺损伤*

肖 归， 陈广文， 李 涛， 张华莉， 王慷慨， 刘梅冬， 刘 可， 肖献忠△

（1中南大学湘雅医学院病理生理学系，湖南 长沙 410008；2海南医学院国际护理学院，海南 海口 571199；3嘉应学院医学院病理学与病理生理学教研室，广东 梅州 514000）

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是一种由病毒、细菌感染、外伤、中毒、脓毒症或者休克等非心源性因素造成的急性进行性缺氧性呼吸衰竭。如果得不到控制，ALI 将发展为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），最终导致死亡［1-3］。ALI 发病率和病死率高，且目前各种治疗方法效果不理想，因此在临床治疗和基础研究中都引起了高度的重视［4-5］。ALI 主要表现为进行性呼吸窘迫和低氧血症，其病理改变主要是微血管病变、肺泡通透性增加、大量炎症细胞浸润和炎症介质的产生增加。ALI 发病机制非常复杂，至今尚未完全阐明，但研究已经确定炎症反应是最主要的机制之一。

热休克因子1（heat shock factor 1，HSF1）是一种与热休克反应有关的转录因子，能够调节热休克蛋白（如Hsp27、Hsp60和Hsp70）的转录，在肺部炎症和损伤中发挥重要的细胞保护作用［6-10］。本课题组之前的研究表明，HSF1 对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的多器官功能障碍［11］和ALI［12］均具有抑制作用。此外，HSF1 能够减少肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）等炎症介质的产生，减轻炎症反应［13-15］。然而，HSF1减轻ALI的潜在机制仍不明确，需要进一步探索。

中性粒细胞是ALI 发病机制中的重要效应细胞，其激活和迁移与ALI 的严重程度密切相关。活化的中性粒细胞能够产生许多细胞毒性物质，包括颗粒酶、活性氧、活性脂、各种促炎细胞因子和中性粒细胞胞外陷阱，它们可导致肺组织细胞损伤，对ALI 发展至关重要［16］。然而，HSF1 对ALI 中性粒细胞细胞的影响仍不明确。本研究旨在研究HSF1 对趋化因子调节作用和对中性粒细胞浸润的影响，探讨HSF1对LPS所致ALI的保护作用及其分子机制。

材料和方法

1 动物

SPF 级HSF1−/−和HSF1+/+小鼠由美国德克萨斯大学西南研究中心Dr.Ivor J.Benjamin惠赠，统一喂养在中南大学湘雅医学院实验动物中心，由专人负责小鼠基因型检测，获取雄性HSF1−/−和HSF1+/+小鼠，2～3 月龄，25 g 左右。小鼠分为HSF1+/++生理盐水（nor‑mal saline，NS）组、HSF1+/++LPS 组、HSF1−/−+NS 组和HSF1−/−+LPS 组，其中HSF1+/++LPS 组和HSF1−/−+LPS组按照5 mg/kg 的剂量从气管滴注LPS（浓度0.8 mg/mL），而HSF1+/++NS组和HSF1−/−+NS组从气管滴注同等体积的NS。

2 主要试剂

LPS（大肠杆菌055：B5）购自Sigma；Purified rat anti-mouse CD16/CD32（货号553142）、PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse CD45（货号555483）、FITC anti-mouse Ly6G（货号551459）和70 μm cell strainer 购自BD；APC anti-mouse/rat XCR-1（货号372603）购自Bio‑Legend；XCL-1 ELISA 试剂盒购自Raybiotech；antimouse Ly6G antibody 和anti-goat XCR-1 antibody 购自Santa Cruz；4% 多聚甲醛购自北京鼎国公司；PBS 购自欧盟公司。

3 主要方法

3.1 小鼠ALI 模型的建立按照之前的方法构建小鼠ALI 模型［12］。用0.3% 戊巴比妥钠（0.01 mL/g体重）腹腔注射麻醉小鼠，暴露小鼠气管后，用1 mL注射器缓慢滴加LPS（5 mg/kg，浓度为0.8 mg/mL）入气管内，竖立起小鼠，旋转，使LPS 分布均匀，对照组给予NS 气管内滴注，滴注LPS 或NS 12、24 和36 h 后检测各项指标。

3.2 收集小鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）分别于注射LPS 或NS 12、24 和36 h 后将小鼠用颈椎脱臼法安乐死，将小鼠固定在干净的泡沫板上，用消毒灭菌后的眼科剪剪切小鼠颈部皮肤，暴露气管，用镊子从下穿过气管，在靠近小鼠头部的气管切一小斜切口，将套管针轻柔插进气管，拔出硬针，确保套管针固定在气管内。用1 mL注射器抽1 mL PBS 缓慢注入支气管，用手指轻轻震荡小鼠胸廓1 min，用1 mL 注射器回抽液体，保存在EP 管中（冰上），接着再用1 mL PBS 灌洗支气管肺泡，重复3次，第1管回抽率为60%～70%，第2管和第3 管回抽率为80%～90%。 将存有BALF 的EP 管4 ℃、1 500 r/min 离心5 min。第1 管BALF 的上清用于XCL-1 检测，所有EP 管中的细胞收集起来用于中性粒细胞和XCR-1流式细胞术检测。

3.3 流式细胞术用上述收集的细胞进行流式细胞术检测，将BALF中所有的细胞悬浮在1 mL 1×红细胞裂解缓冲液（BD Biosciences）中5 min，然后250×g离心5 min。将含有BALF 细胞的上清液重悬于100 μL PBS 中，用0.5 μL 纯化的大鼠抗小鼠CD16/CD32抗体在4 ℃下封闭10 min。BALF细胞用荧光偶联抗体（PerCP-Cy™5.5 大鼠抗小鼠CD45 抗体0.5 μL、FITC 抗小鼠Ly6G 抗体0.5 μL 和APC 抗小鼠XCR-1抗体0.5 μL）在4 ℃下避光20 min，然后以250×g离心5 min。上清液用100 μL 2% 多聚甲醛4 ℃避光固定10 min，上流式细胞仪（BD Biosciences，LSRⅡ）检测，使用FlowJo软件分析数据。

3.4 ELISA使用ELISA 试剂盒（RD），根据说明书操作，检测肺组织匀浆、BALF和血清中XCL-1水平。

3.5 免疫荧光染色滴注LPS 或NS 12、24 和36 h后，将小鼠用颈椎脱臼法安乐死，并立即取出左肺放于4% 多聚甲醛中固定24 h。石蜡包埋后，将肺组织切成4 μm 厚的切片。将切片置于柠檬酸钠缓冲液中并在100 ℃的微波中加热15 min，然后与PBS 中的10% 牛血清白蛋白在室温下孵育2 h 以封闭非特异性结合位点。随后，切片与鼠中性粒细胞单克隆抗体（抗Ly6G 抗体；1∶200）和抗XCR-1 抗体（1∶100）在4 ℃下过夜，然后与辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗（1∶50；ABclonal）在37 ℃下避光孵育1 h。用PBS 洗涤4次后，用密封液处理样品。使用Panoramic 250/MIDI（Hungary）拍片。

4 统计学处理

使用GraphPad Prism 7.0 和SPSS 21.0 分析所有数据。计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示。两组样本之间比较选用独立样本t检验，多组比较使用单因素方差分析（one-way ANOVA）。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 HSF1对LPS 所致的ALI小鼠BALF 中性粒细胞百分率的影响

本研究使用CD45+LY6G 标记中性粒细胞，采用流式细胞术检测各组小鼠不同时点BALF 中性粒细胞百分率的变化。如图1 所示，在12、24 及36 h，HSF1−/−+LPS 组小鼠BALF中性粒细胞比例均高于HSF1+/++LPS 组小鼠（P<0.01），24 h 时BALF 中性粒细胞含量最高，这与炎症状态下经典炎症细胞迁移的过程相符。以上结果表明，HSF1 能减轻LPS 所致的ALI肺泡中性粒细胞的浸润。

2 HSF1对LPS所致ALI小鼠肺组织中性粒细胞浸润的影响

采用免疫荧光方法分别检测小鼠肺组织中性粒细胞数目，结果见图2。12 h、24 h 时和36 h 时，与HSF1+/++LPS 组相比，HSF1−/−+LPS 组肺组织中的中性粒细胞浸润更多（红色箭头），表明HSF1 能减轻LPS所致急性肺损伤小鼠肺组织中的炎症细胞的浸润。

3 HSF1 对LPS 所致ALI 小鼠血清、肺组织和BALF中趋化因子XCL-1浓度的影响

3.1 血清中XCL-1 的浓度LPS 处理12、24 和36 h后，HSF1−/−+LPS 组小鼠血清中XCL-1 水平显著高于HSF1+/++LPS 组（P<0.05），且在24 h 达到高峰（P<0.01），见图3。以上结果表明，HSF1 可能通过抑制血清中XCL-1 的表达水平来抑制中性粒细胞浸润，从而发挥保护作用。

3.2 肺组织中XCL-1 的浓度LPS 处理12、24 和36 h 后，HSF1−/−+LPS 组小鼠肺组织中XCL-1 水平显著高于HSF1+/++LPS 组（P<0.05），且在24 h 达到高峰（P<0.01），这与血清的结果相一致，见图4。以上结果表明，HSF1 可能通过抑制肺组织中XCL-1 的表达水平来抑制中性粒细胞浸润，从而发挥保护作用。

3.3 BALF 中XCL-1 的浓度与HSF1+/++LPS 组相比，12 和24 h 时，HSF1−/−+LPS 组BALF 的XCL-1 水平显著高于HSF1+/++LPS 组（P<0.01），且在24 h 达到高峰；36 h 时，HSF1−/−+LPS 组BALF 的XCL-1 水平略高于HSF1+/++LPS 组（P<0.05），见图5。以上结果表明，HSF1 可能通过抑制肺泡中XCL-1 的表达水平来抑制中性粒细胞浸润，从而发挥保护作用。

4 HSF1对LPS 所致ALI小鼠BALF 中性粒细胞表面XCR-1表达的影响

LPS处理12 h后，HSF1−/−+LPS组小鼠BALF 的中性粒细胞表面XCR-1 比例高于HSF1+/++LPS 组（P<0.01）；24 h 时，HSF1−/−+LPS 组 和HSF1+/++LPS 组BALF 的中性粒细胞表面XCR-1 均有增加，HSF1−/−+LPS 组小鼠BALF 的中性粒细胞表面XCR-1 比例仍高于HSF1+/++LPS 组（P<0.01）；36 h 时，HSF1−/−+LPS组小鼠BALF 的中性粒细胞表面XCR-1 水平仍高于HSF1+/++LPS 组，见图6。以上结果表明，在LPS 所致的ALI模型中，HSF1能通过抑制中性粒细胞上XCR-1表达而发挥对中性粒细胞浸润的抑制作用。

讨 论

Figure 1.The effect of HSF1 on percentage of neutrophils in BALF of ALI mice induced by LPS.Mean±SD. n=6.##P<0.01 vs HSF1+/++NS group；**P<0.01 vs HSF1+/++LPS group.图1 HSF1对LPS所致ALI小鼠BALF中性粒细胞百分率变化的影响

肺组织因为独特的解剖结构非常容易遭受外界有害物质的损伤，不少研究者发现，当肺脏受到LPS等刺激时，大量中性粒细胞会从血管游出聚集到肺部，并释放大量的细胞因子，引起体内促炎和抗炎系统失衡，从而进一步激活炎症细胞，导致ALI/ARDS的发生［17］。HSF1是必不可少的热休克基因，HSF1−/−动物的细胞在遭受高温等刺激时，相比于野生型动物更容易凋亡，这证明了HSF1能够提高细胞的存活率［18-20］。HSF1能够提高存活率这一现象在很多动物中也有证实。 本课题组在前期研究中也发现，HSF1−/−小鼠对LPS 的敏感性显著增强，并且其生存率显著降低，且HSF1 能够有效减少内毒素血症中TNF-α、IL-1β 和IL-6 等炎症因子的表达水平，表明HSF1 对LPS 所导致的内毒素血症具有明显的抑制作用［21］。本课题前期采用HSF1−/−小鼠经气管内滴注LPS 制备了小鼠ALI 模型，并通过检测肺湿/干重、肺组织病理学改变、BALF 蛋白定量、BALF 和肺组织中VEGF 的含量等确认小鼠ALI 模型建立成功，且发现HSF1 明显减轻LPS 所致的ALI，但其作用机制仍不明确［12］。因此，本研究中我们继续使用上述小鼠ALI模型，采用流式细胞术检测了LPS 处理12、24 和36 h后各组小鼠BALF中性粒细胞含量，并采用免疫荧光法检测了不同组别小鼠肺组织中性粒细胞含量。结果发现，HSF1−/−+LPS 组的中性粒细胞含量均高于HSF1+/++LPS 组，说明在LPS 诱导的ALI 时，HSF1 能够抑制中性粒细胞在肺部的浸润。

Figure 2.The effect of HSF1 on infiltration of neutrophils in the lung tissues of ALI mice induced by LPS（immunoflurorescence，×40）.图2 HSF1对LPS所致ALI小鼠肺组织中性粒细胞浸润的影响

Figure 3.The effect of HSF1 on the serum concentration of XCL-1 in ALI mice induced by LPS.Mean±SD. n=6.#P<0.05，##P<0.01 vs HSF1+/++NS group；*P<0.05，**P<0.01 vs HSF1+/++LPS group.图3 HSF1对LPS所致ALI小鼠血清中XCL-1浓度的影响

Figure 4.The effect of HSF1 on the concentration of XCL-1 in the lung tissues of ALI mice induced by LPS.Mean±SD. n=6.#P<0.05，##P<0.01 vs HSF1+/++NS group；*P<0.05，**P<0.01 vs HSF1+/++LPS group.图4 HSF1对LPS所致ALI小鼠肺组织中XCL-1浓度的影响

Figure 5.The effect of HSF1 on the concentration of XCL-1 in the BALF of ALI mice induced by LPS.Mean±SD.n=6.#P<0.05，##P<0.01 vs HSF1+/++NS group；*P<0.05，**P<0.01 vs HSF1+/++LPS group.图5 HSF1对LPS所致ALI小鼠BALF中XCL-1浓度的影响

HSF1 究竟通过何种分子机制抑制中性粒细胞在ALI 小鼠肺部的浸润呢？在肺部炎症时，最开始中性粒细胞趋化到肺血管的能力比较弱，随着中性粒细胞和肺血管内皮细胞变得活化，并释放趋化分子和黏附分子，中性粒细胞进入肺循环的能力变强，并且能够穿过肺血管内皮细胞、肺泡上皮细胞和肺间质渗出到肺泡腔中。研究证明，XCL-1 是其中非常关键的趋化分子［22］。XCL1 是C 族趋化因子家族的一员。XCR-1 是其特异性受体，主要表达在在中性粒细胞、T 细胞、NK 细胞和B 细胞表面。XCL-1 通过与XCR-1 相互作用，产生趋化效应［23］。在本科室前期工作中，采用含有384 个炎症因子基因的微阵列，利用HSF1−/−和HSF1+/+小鼠制备了内毒素血症模型，采用该模型小鼠的肺组织，筛选出了HSF1 调控的相关炎症基因，发现HSF1 可能抑制XCR-1 的表达［24］。进一步生物信息学分析发现，在XCR-1转录起始位点上游，存在HSF1 结合位点；通过进一步生物信息学分析，我们发现XCL-1的启动子区也含有HSF1 的结合位点。因此，我们推测HSF1 对LPS 所致ALI 小鼠肺组织中性粒细胞浸润的抑制作用可能是通过调节XCL-1/XCR-1 这一对趋化因子配体/受体的表达来实现的。据此，我们通过ELISA 检测了小鼠血清、肺组织及BALF 中XCL-1 的表达水平，并采用流式细胞术检测了BALF 中性粒细胞表面XCR-1 的表达水平。结果发现，小鼠敲除HSF1后，在LPS所致的ALI模型中，血清、肺组织和BALF中的XCL-1水平以及BALF 中性粒细胞表面的XCR-1 水平均高于野生型小鼠。因此，HSF1 可能是通过抑制XCL-1及中性粒细胞表面XCR-1 的表达，从而发挥对中性粒细胞浸润的抑制作用。但HSF1 是否是在转录水平直接调节XCR-1的表达尚需要进一步研究。

Figure 6.The effect of HSF1 on the expression of XCR-1 on the nuetrophils in BALF of ALI mice induced by LPS.Mean±SD. n=6.#P<0.05，##P<0.01 vs HSF1+/++NS group；*P<0.05，**P<0.01 vs HSF1+/++LPS group.图6 HSF1对LPS所致ALI小鼠BALF的中性粒细胞表面XCR-1表达的影响

总之，本研究证明了HSF1 通过抑制XCL-1/XCR-1 这一对趋化因子配体/受体的表达，抑制了中性粒细胞在肺组织的迁移和浸润，从而减轻了LPS所致的肺损伤，这对进一步揭示ALI/ARDS 的潜在防治靶点有着重要意义。