绿色荧光蛋白标记解淀粉芽孢杆菌Bam22在油菜体内的定殖

杨潇湘，黄小琴，张 蕾，张重梅，鲜贇曦，周西全，刘 勇

（1四川省农业科学院植物保护研究所，成都 610066；2农业农村部西南作物有害生物综合治理重点实验室，成都 610066）

0 引言

植物病害生物防治是实现生态农业可持续发展的重要措施，而生防拮抗菌的运用是生物防治的重要途径之一[1]。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)作为一类重要的生防菌，既能产生肽类、蛋白质、吡嗪类和酚类等多种抗菌物质[2]，也可以提高土壤酶活性，改善土壤微生物区系，从而提高土壤肥力[3]。然而，这类生防微生物在田间应用时，时常无法达到预期的生防效果。这可能与其在植物根围或内部有效定殖的能力差有关[4-5]。成功的定殖是发挥促生防病等效果的先决条件。因此，除了研究其促生防病机制外，也有必要探究其在植株体内的定殖能力和定殖规律。研究生防菌定殖的常用方法有同位素示踪法[6]、抗生素抗性标记法[7]、生化显色标记法[8]和荧光标记法[9]等。其中，荧光标记法中的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)标记法因标记基因小、灵敏度高（可检测单个的菌体）和稳定性好等优点，在实时、原位研究微生物的空间定位、微生物与环境和宿主的相互作用等方面展示了良好的应用前景[10-11]。利用GFP标记生防菌株已在多种芽孢杆菌上取得成功，如枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌等[12-14]。解淀粉芽孢杆菌菌株Bam22是分离自油菜根际土壤的具有生防潜力的微生物。前期研究发现，该菌株对根肿病菌(Plasmodiophora brassicae)[15]、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)[16]、腐 皮 镰 孢 菌 (Fusarium solani)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)和链格孢(Alternaria alternate)等多种病原菌的生长和孢子萌发具有较好的抑制作用，并且表现出对多种作物较强的促生作用[15]。进一步开发利用该菌株，首先要明确其在植株体内的定殖能力和定殖规律。本研究利用自然转化法将含有绿色荧光蛋白基因的穿梭载体pGFP4412导入Bam22细胞中，获得GFP标记菌株，并进一步对标记菌株的遗传稳定性、生长曲线、抑菌能力及其在油菜体内的定殖进行研究，旨在为解析其抗菌防病促生机制、制定科学施用技术和该菌株的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株与质粒 解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)Bam22、根 肿 菌 (P.brassicae)CZPb4、灰 葡 萄 孢 (B.cinerea)B13、核盘菌(S.sclerotiorum)Ss-1、腐皮镰孢菌(F.solani)FoHJ9和链格孢(A.alternata)AlYY11均由笔者所在实验室分离、鉴定和保存。大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体pGFP4412，带有卡那霉素(Km)抗性基因和GFP基因，由中国农业大学王琦教授惠赠。

1.1.2 植物材料‘川油36’是由四川省农业科学院作物研究所选育而成的油菜品种。

1.2 方法

1.2.1 Bam22的GFP标记 采用Idris等[17]的两步法转化解淀粉芽孢杆菌Bam22，略作修改。挑取新鲜划线的单菌落于液体LB培养基中，33℃、170 r/min过夜振荡培养；次日吸取一定体积的培养物于GCHE培养液中，使其OD600=0.3左右；33℃、200 r/min振荡培养至OD600=1.4左右；加入等体积的GC培养液，继续培养约1.5 h；将此时的培养物均分成2份，5000 r/min室温离心5 min；取200 μL上清液重悬沉淀，加入2 mL转化缓冲液和1 μg的pGFP4412质粒，轻轻混匀后放置于33℃培养箱1 h，期间每10～15 min轻轻颠倒混匀1次，加入含亚致死浓度的卡那霉素的LB培养液，33℃、170 r/min培养2～3 h，8000 r/min离心5 min，取400 μL上清液重悬沉淀后均匀涂布于含卡那霉素的LB平板上，次日观察有无抗性菌落出现，并进行荧光显微镜观察验证。

1.2.2 标记菌株的遗传稳定性 以0.1%(v/v)比例取过夜活化的菌株Bam22-GFP加入到无抗生素的LB培养液中，33℃、170 r/min培养5 h；再重复以相同的比例将培养液转接于无抗生素的LB体培养液中，相同条件下重复培养10次。将培养10轮后的培养液稀释一定倍数后涂布于不含与含卡那霉素的LB平板，统计2种平板上的菌落数，并采用荧光显微镜观察验证。

1.2.3 生长曲线测定 菌株Bam22和Bam22-GFP在无抗生素的液体LB，33℃、170 r/min过夜活化，加入适量的LB液体使OD600=1.0左右，以1%(v/v)接种比例分别接种至LB液体培养基中，33℃、170 r/min振荡培养。在接种后的第0、5、10、15、20、25、30、35 h分别测定培养物的OD600，绘制其生长曲线。

1.2.4 标记菌株对病原真菌的抑菌能力测定 用5 mm打孔器在活化的灰葡萄孢、核盘菌、腐皮镰孢菌和链格孢菌落的边缘打取菌饼，并置于PDA平板中央。在距菌饼2.5 cm处点接1 μL过夜活化的Bam22和Bam22-GFP菌液。25℃下培养3～5天，观察抑菌圈大小。

1.2.5 标记菌株对根肿菌休眠孢子萌发抑制的测定

（1）油菜根系分泌物的收集。参照刘翠平[18]的方法，将催芽后的油菜移到装有Hoagland营养液的50 mL小烧杯的纱布上，每杯10颗，在24℃恒温培养箱中光暗交替培养7天后收集根系分泌物溶液。根系分泌物溶液经细菌过滤器（滤膜孔径为0.22 μm）过滤后，保存于4℃冰箱备用。

（2）根肿菌休眠孢子的提取。参照杨佩文等[19]的方法，略作修改。将10 g油菜根肿组织消毒清洗后切碎，加50 mL蒸馏水于搅拌机内搅成匀浆，用纱布过滤后将滤液转移到干净的50 mL离心管中，然后在离心机中3100 r/min离心15 min；倒掉上清液，使沉淀重溶于50 mL无菌水，再3100 r/min离心10 min，重复该操作3次；弃上清将沉淀溶于50%的蔗糖溶液，3100 r/min离心10 min，将上清液转移到干净的离心管中，再加入30 mL无菌水，3100 r/min离心10 min；倒掉上清液，重复该操作3次，用血球计数板法统计孢子含量，最后用无菌水制成109个孢子/mL的悬液，置于4℃冰箱保存备用。

（3）解淀粉芽孢杆菌无菌发酵滤液的制备。分别挑取Bam22和Bam22-GFP单菌落接种到装有150 mL LB培养液的250 mL三角瓶中，33℃、170 r/min振荡培养3天，8000 r/min离心15 min，上清液经细菌过滤器（滤膜孔径为0.22 μm）过滤后，保存于4℃冰箱备用。

（4）休眠孢子萌发抑制实验。参照刘翠平[18]的浅层液体培养法，用制备的根系分泌物溶液将根肿菌休眠孢子浓度稀释为107个/mL备用。取4.5 mL含有根系分泌物的根肿菌休眠孢子悬浮液至50 mL灭菌三角瓶中，再加入0.5 mL解淀粉芽孢杆菌无菌发酵滤液，以等量LB培养液代替解淀粉芽孢杆菌无菌发酵滤液作为空白对照，每个处理设置3次重复。25℃、黑暗条件培养7天后采用地衣红染色法观察休眠孢子的萌发情况。

1.2.6 标记菌株的回收及其在油菜体内定殖观察 选取长势一致的油菜幼苗，采用室内盆栽灌根法进行标记菌株的回收及其在油菜体内定殖观察。每株油菜幼苗接种20 mL 1.00×107CFU/mL的Bam22-GFP菌液于油菜根围，以LB培养基为对照，每处理重复20株。分别于菌液灌根后1、7、15、30、45天后取样，取油菜根、茎、叶组织，用无菌水冲洗3次，研磨后稀释成不同浓度，静置3 min，取200 μL汁液涂于含20 μg/mL卡那霉素的LB平板上，33℃下培养36 h，在紫外投射仪照射下统计平板上发绿色荧光的菌落数，按公式(1)确定烟草植株体内的标记菌株量。在灌根后第7天，取油菜根、茎组织，用无菌水冲洗4次后，在荧光显微镜下观察Bam22-GFP在油菜体内的定殖情况。

1.3 数据分析

采用Excel 2010和SPSS 22.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 解淀粉芽孢杆菌Bam22的GFP标记

用自然转化法将携带GFP标记基因的大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pGFP4412导入解淀粉芽孢杆菌Bam22自然感受态细胞。挑取在含有卡那霉素的LB平板上长出的抗性菌落，在荧光显微镜下检测到菌株发出强烈的绿色荧光，菌体形态为典型的杆状，表明GFP在Bam22的细胞内被成功表达（图1）。Bam22-GFP经不含卡那霉素的LB培养液继代培养10次后，将菌液稀释一定倍数分别涂布于不含与含卡那霉素的LB平板，统计2种平板上的菌落数，并采用荧光显微镜观察验证。结果表明，含有卡那霉素抗性且会发荧光的菌株占菌落总数的比例为72%，表明质粒pGFP4412在Bam22细胞中较为稳定，标记菌株适于定殖研究。

图1 Bam22-GFP的荧光观察

2.2 野生菌株和GFP标记菌株的生长曲线比较

从野生菌株Bam22与GFP标记菌株Bam22-GFP在LB培养液中的生长曲线（图2）可以看出，菌株Bam22与Bam22-GFP的生长曲线的变化趋势基本相同。说明外源质粒的引入和GFP蛋白的表达对宿主菌的生长量并未产生明显影响。

图2 Bam22与Bam22-GFP的生长曲线

2.3 野生菌株和GFP标记菌株的抑菌能力比较

野生型菌株Bam22对多种病原菌均表现出较好的抑菌效果。因此，通过平板对峙法比较了Bam22和Bam22-GFP对灰葡萄孢、核盘菌、腐皮镰孢菌及链格孢的抑制效果。由图3可知，Bam22-GFP对灰葡萄孢、核盘菌、腐皮镰孢菌及链格孢的抑菌效果与野生型菌株Bam22无明显差异。进一步采用地衣红染色法比较野生菌株和GFP标记菌株抑制根肿菌休眠孢子萌发的能力。在普通光学显微镜下观察，着红色的是未萌发的休眠孢子，未着色的是萌发的休眠孢子。由图4可知，与对照相比，Bam22-GFP与Bam22均对根肿菌休眠孢子萌发具有较好的抑制能力，两者无差异。结果说明，外源质粒的引入对Bam22的抑菌能力并无太大的影响，Bam22-GFP可用来研究Bam22的生防效果和定殖规律。

图3 Bam22与Bam22-GFP的抑菌能力

图4 Bam22-GFP对根肿菌休眠孢子萌发的影响

2.4 标记菌株在油菜上的定殖

采用灌根法研究Bam22-GFP在油菜上的定殖，分别于菌液灌根后1、7、15、30、45天后取样，采用含有卡那霉素的LB平板进行标记菌株的分离和统计。对照处理所有阶段的样品涂布于卡那霉素LB平板上均无芽孢杆菌菌落生长，而Bam22-GFP灌根处理后的样品涂布在卡那霉素LB平板上均有菌落生长；Bam22-GFP在油菜根、茎、叶部位的定殖趋势一致，均呈现先上升后下降的趋势，但根部菌落数显著高于茎和叶；灌根后第7天，根、茎、叶的Bam22-GFP菌落数均达到峰值，分别为3.55×103、2.89×103、1.23×103CFU/g菌落；随着时间推移，各部位的菌落数逐渐降低，但到第45天时，仍然可以在根、茎和叶组织中回收到少量标记菌株（图5）。此外，在灌根后7天可通过荧光显微镜明显观察到Bam22-GFP聚集在根、茎部的皮层和维管束部位（图6）。标记菌落的回收和荧光显微镜观察结果均表明，Bam22-GFP能够定殖在油菜植株内部，并在油菜体内传导。

图5 Bam22-GFP在油菜上的定殖动态

图6 荧光显微镜观察Bam22-GFP在油菜上的定殖

3 结论与讨论

本研究将携带绿色荧光蛋白基因的质粒pGFP4412导入解淀粉芽孢杆菌Bam22细胞中，标记菌株Bam22-GFP在荧光显微镜下发出强烈的绿色荧光，其生长和对多种病原菌真菌及根肿菌休眠孢子萌发的抑制效果较野生型菌株Bam22无明显差异。Bam22-GFP可通过灌根方式进入油菜体内定殖和传导，定殖时间长达45天。

随着人类环保意识的增强以及对自身生活品质的关注，利用环境友好的有益微生物进行防治植物病害已成为保障农业可持续发展的重要手段，引起越来越多的重视。然而，生防微生物在田间应用时常因定殖能力差而导致病害防治效果不理想[4-5]。因此，生防微生物在植株体内有效定殖是其发挥防病和促生作用的前提与关键因素。生防微生物的定殖研究备受植物病理工作者的关注。近年来，标记基因技术的建立和发展为原位实时动态的观测微生物的定殖及其与植物的互作提供了强有力的工具。其中，GFP具备无需外源反应底物、操作简单、检测方便以及可原位实时动态观察等特点，已经成为当代研究目标微生物在自然环境中的释放、生存、定殖以及与植物互作等最为成功的标记基因[10-11]。但研究表明，GFP在微生物体内的高效表达会造成某些标记菌株额外的代谢负担，可能影响其生理代谢活动和生物学功能[20]。本研究成功将携带GFP的质粒pGFP4412导入解淀粉芽孢杆菌Bam22中，标记菌株Bam22-GFP与野生菌株Bam22在生长和抑菌能力等方面无明显差异，说明pGFP4412的导入和GFP蛋白的表达并未对该菌株的生长和生防功能产生明显的影响，而且质粒的遗传稳定性较好。这与采用质粒pGFP4412进行荧光标记蜡样芽胞杆菌[21]、枯草芽孢杆菌[22]等菌株的结果一致。

解淀粉芽孢杆菌Bam22菌株的成功标记为研究其在植物体内的定殖情况奠定了良好的基础。对油菜采用Bam22-GFP菌液灌根法处理，发现Bam22-GFP能通过根部进入油菜内部，并在植物体内传导，从根部传导至茎部和叶部。在测定时间内油菜各组织菌落数量均表现出先上升后下降趋势，根部菌落数显著高于茎和叶，说明采用灌根法尤其利于菌株在根部的定殖，适合用于防治油菜根部病害，如油菜根肿病。下一步将采用喷叶法研究Bam22在油菜体内的定殖情况和对叶部病害的防治效果。

田间根肿菌存在多优势小种混生现象，导致抗病品种抗性不稳定，目前根肿病的防治主要依赖于大量化学药剂灌根处理。但大量使用化学农药容易导致抗药菌株产生，造成环境污染，引起人畜中毒等问题[23-25]。本研究发现，在灌根后45天仍然能在油菜植株各组织检测到标记菌株存在，采用Bam22进行油菜种子包衣处理或苗期灌根处理，理论上可抑制油菜根围根肿菌休眠孢子的萌发，并且持效期较长。为此，发展以Bam22为主的有益微生物防治措施或许是目前解决十字花科作物根肿病危害的理想途径。Bam22除了可以抑制油菜根肿菌休眠孢子的萌发外，还对多种其他植株的病原真菌具有较好的抑制效果。然而，笔者只研究了Bam22-GFP在油菜体内的定殖情况，该菌株能否在其他植物体内稳定定殖，进而发挥防治效果，还需进一步研究，为大范围推广Bam22提供依据。

综上，本研究明确了淀粉芽孢杆菌Bam22在油菜上的定殖动态和规律，有助于进一步了解菌株的防病促生机制，为制定科学施用技术和该菌株的开发利用提供了理论基础。