比格犬关节滑液代谢组学研究*

刘清平 黄永平 陈 芸 万 娟 田 松 贺争鸣 胡曼丽 丁 一 白 兰 张 鑫

(1.赣南创新与转化医学研究院；心脑血管疾病防治教育部重点实验室；赣南医学院附属第一医院，赣南医学院，赣州 341000)(2.武汉大学生命科学学院，武汉 430072)(3.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241)(4.武汉大学人民医院，武汉 430060)(5.中国食品药品检定研究所，北京 100050)(6.华中农业大学动物医学院，武汉 430070)

随着经济发展和消费业态的改变，我国养宠理念在过去十余年发生明显改变，宠物逐渐转变为家人、伴侣的角色。目前全国宠物数量超过1亿只，其中有约50%的宠物正承受着关节疾病的困扰[1]。以宠物犬为例，先天关节发育不良和风湿性关节炎多见于幼犬，类风湿性关节炎常见于成年犬，犬关节炎则多发于老年犬[2]。宠物关节保健至关重要，及早对宠物进行关节养护能有效减轻宠物不同时期关节损伤和疼痛。犬关节炎临床治疗主要采取抗炎和镇痛措施，而批准上市的宠物专用抗炎镇痛药稀少，常用药物美洛昔康在有效治疗犬关节炎的同时却引起胃肠道不良反应，不适合作为长期养护关节的策略。此外，由于缺乏对宠物关节疾病机制的深入研究和理解，目前市面上关于宠物的关节营养产品，大多只停留在补钙或单种成分补充的初级阶段，导致众多宠物的关节问题无法有效解决。因此，充分认识犬关节发育的代谢特征，有针对性地补充不同时期关节所需营养，才能有效地保证宠物关节和骨骼的健康。

代谢组学关注内源性代谢物(相对分子质量小于1 500)在生命体系受外界刺激(如疾病侵袭、药物干预、环境变化等)、病理生理变化以及本身基因突变所产生的应答变化规律[3-4]。目前广泛应用于疾病诊断、药靶筛选、个性化药物治疗、作用机制研究和基因功能阐明，为疾病过程认识和药物理论体系的研究提供了整体的思路和系统的方法[4-5]。非靶向代谢组学使用高分辨质谱仪，对样本中的代谢物进行无偏向、大规模、系统性检测，最大程度反映生物体内代谢水平扰动情况[6]。液相色谱法与质谱法(LC-MS)相结合，在分析复杂生物流体(如关节腔滑液)方面显示出巨大优势[7]。

本研究使用超高效液相色谱-串联飞行时间质谱联用仪(UHPLC-Q-TOF MS)进行犬关节腔滑液代谢组学检测和分析，选取幼年和成年比格犬的关节滑液，研究这两个年龄段的关节腔滑液的代谢特征，寻找其在犬不同年龄段的代谢差异，从而发现比格犬关节发育与关节滑液代谢成分变化的关系。本研究基于LC-MS的代谢组学谱作为量化关节腔滑液内代谢物的工具，发现犬在不同发育阶段的关节代谢标志物，用于探索犬关节发育的特征和关节养护的策略研究。

1 材料和方法

1.1 实验动物

实验选取体格正常的18只幼年(<12个月；雌、雄各9只)比格犬和16只成年(≥12个月且≤65个月；雌、雄各8只)比格犬，在受控的标准环境【12 h∶12 h昼夜间断照明，温度(23.5±1)℃，相对湿度(60±10)%】中适应性饲养。犬基础饲料购买自江苏省协同医药生物工程有限责任公司。适应性饲养2周后进行基础体检，评估比格犬骨关节和生理健康水平。所有动物实验经赣南医学院生物医学研究伦理委员会审查，伦理审批号：2021334，符合美国国家科学院和美国国立卫生研究院发布的《实验动物护理和使用指南》。

1.2 设备及试剂

AB Triple TOF 6600质谱仪(AB SCIEX)、Agilent 1290 Infinity LC超高压液相色谱仪(Agilent)、低温高速离心机(Eppendorf 5430R)、色谱柱(Waters, ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm, 2.1 mm×100 mm column)、DigiEye 380 DR X线摄影装置(深圳迈瑞)、乙腈(Merck,1499230-935)、乙酸铵(Sigma,70221)、甲醇(Fisher, A456-4)、氨水(Fisher, A470-500)、硫酸阿托品(吉林华牧)、舒泰50(法国维克)。

1.3 血常规分析

动物完成基础体检后，将采血针插入头远端静脉采集少量静脉血。将全血标本送往惠康动物检测(武汉)有限公司医学检验实验室进行常规血液检查。

1.4 骨关节X线分析

为防止实验犬麻醉后食道中食靡和水反流导致窒息死亡，X线检查前对实验犬进行常规禁食禁水(禁食12 h，禁水4 h)。麻醉采用0.04 mg/kg皮下注射硫酸阿托品，15 min后按5 mg/kg静脉推注舒泰50，待实验犬意识消失，全身肌肉松弛后拍摄X线片。将犬置于诊断床上“仰卧保定”，进行腹背位拍片，X线片暗盒放在两髋关节与诊断床之间，荐椎与腰椎紧贴暗盒的中心线。一助手握住犬的两前脚向前拉使两个腕关节与诊断床的中心线成等距离平行，另一助手紧握两个膝关节向后拉使两股骨与诊断床的中心线或等距离平行。根据犬体型选择投照条件，本实验中投照条件为70 kV，2.5 mAs，FFD=56 cm。

1.5 关节滑液采集

使用1 mL注射器从比格犬左后肢膝关节抽取关节滑液样本0.1 mL，避免血液及毛发等污染。将关节滑液收集到EP管中，通过在室温环境下4 000 r/min离心20 min，从滑液中除去细胞，然后在液氮中快速冷冻至少15 min，并在-80 ℃下储存。

1.6 非靶向代谢组学

在4 ℃环境下缓慢解冻关节滑液样品，将100 μL样品与400 μL预冷的甲醇/乙腈/水溶液(2∶2∶1, v/v)涡旋混匀，低温超声30 min，-20 ℃静置10 min，然后离心20 min(12 000 r/min，4 ℃)，取上清真空干燥。将干燥的样品重新溶解在100 μL乙腈水溶液(1∶1，v/v)中并涡旋混合，然后离心15 min(12 000 r/min，4℃)，收集上清液送往上海中科新生命生物科技有限公司进行非靶向代谢组学分析。

关节滑液样品的代谢物在Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色谱系统(UHPLC)HILIC色谱柱进行分离。柱温25 ℃，流速0.5 mL/min，进样量2 μL。流动相组成A含有25 mmol乙酸铵和25 mmol氨水，流动相组成B含乙腈。根据以下梯度程序实现色谱分离：0～0.5 min，95% B；0.5～7 min，65% B；7～8 min，40% B；8～9 min，40% B；9～9.1 min，95% B；和 9.1～12 min，95% B。整个过程中将样品置于4 ℃的自动进样器中。以随机顺序进行连续样品分析，并在队列中插入质控样品以监测和评估系统的稳定性。

样品经色谱分离后，用Triple TOF 6600质谱仪(AB SCIEX)进行质谱分析，采用电喷雾电离(离子源温度：600 ℃)进行正负离子模式检测(离子喷雾电压：±5 500 V，正负两种模式)。MS-only 采集模式的m/z范围设置为60至1 000 u，其扫描累积时间为0.20 s/谱。自动MS/MS采集模式下的m/z范围设置为25至1 000 u，累积时间为0.05 s/谱。离子扫描采用数据依赖型采集，选择峰强度值筛选模式。去簇电位为±60 V(正负两种模式)，碰撞能量为(35±15)eV。动态排除4 u以内的同位素离子，每次扫描采集10个碎片图谱。

将Wiff格式的原始数据通过ProteoWizard转换成mzXML文件，然后导入XCMS软件获取可用数据，然后进行峰对齐、保留时间校正、提取峰面积。对XCMS提取得到的数据首先进行代谢物结构鉴定、数据预处理，然后进行实验数据质量评价，最后进行数据分析。

1.7 多元数据分析

对数据进行归一化(Normalization)、立方根数据转换(Cube root transformation)、Pareto标尺化(Scaling)等处理，以减少变量方差异性，增加数据间的可比性。使用ropls R包、构建有监督的正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)模型，鉴别模型中对于区分各组间代谢谱差异贡献较大的代谢物。并计算了OPLS-DA模型中投影的变量重要性(VIP)。每个变量的VIP值表示特定代谢物对分类的贡献。采用VIP值>1和相应的P值<0.05筛选变化显著的代谢物。

1.8 差异代谢物分析

使用HMDB 5.0版(https://hmdb.ca/)对所得代谢物进行校对，以确定它们的来源是内源性还是外源性。然后，运用KEGG数据库注释代谢产物。在KEGG通路富集分析中，评估属于某个通路的代谢物出现的频率是否比随机预期的更频繁，以确定受到显著影响的代谢和信号传导通路。使用z score方法通过公式y =(真实值-所有样品的平均值)/所有样品的方差来归一化各种代谢物的水平。采用差异丰度(Differential abundance, DA)评分来捕捉途径中所有代谢物的总体趋势。在本研究中应用 Benjamini-Hochberg 校正的 Mann-Whitney U非参数检验来计算某个途径中所有代谢物的差异丰度得分。代谢物丰度的增加/减少定义为阳性/阴性DA评分。具体来说，得分为1表示该途径中所有代谢物的丰度增加，而DA得分为-1表示所有代谢物的丰度降低。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 实验流程示意图

实验选取体格正常的比格犬，首先对其左后肢膝关节进行X线影像检查，然后从左后肢膝关节腔内抽取关节滑液标本100 μL，进行非靶向代谢组学检测。分析比格犬关节滑液的整体代谢图谱，雌、雄性比格犬各自在幼年与成年时期的代谢差异，以及雌性与雄性比格犬关节发育过程中关节滑液的代谢异同(图1)。

图1 实验流程图

2.2 比格犬血常规和膝关节X线影像分析

表1血常规分析显示，幼年犬血液中大部分免疫相关细胞、红细胞和血小板的含量正常，白细胞和中性粒细胞含量略超出临床参考值范围，说明部分幼年犬存在感染和轻度炎症，可能是由于幼年犬免疫力较低所致。图2犬X线影像显示，幼年犬和成年犬的膝关节结构均属正常，无显著性膝关节病变，包括关节骨对位不良、韧带损伤、骨关节炎、关节内骨折、肿瘤等，可排除关节病变导致的关节滑液代谢异常。

图2 比格犬左后肢膝关节X线影像分析

表1 比格犬血常规指标及参考范围

2.3 比格犬关节滑液的整体代谢图谱

采集上述健康比格犬关节滑液进行非靶向代谢组学检测，利用差异代谢物精确m/z值在HMDB(http://www.hmdb.ca/)、METLIN(http://metlin.scripps.edu/)、KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)、PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、LIPID MAPS(http：//www.Lipidmaps.Org/)等数据库检索，结合差异代谢物质谱数据信息(加合离子、准确质荷比、保留时间、MSE二级信息)，寻找信息匹配的可能代谢物。本项目最终共鉴定出1 604种代谢物，其中正离子模式鉴定出1 055种代谢物，负离子模式鉴定出549种代谢物。图3A所示为幼年雌、雄犬和成年雌、雄犬显著性差异代谢物的层次聚类热图，图中每行代表一个差异代谢物(即纵向为显著性差异表达的代谢物)，每列代表一组样品(即横向为样品信息)，黄色代表显著性上调，蓝色代表显著性下调，颜色深浅表示上、下调的程度。

根据化学分类归属信息，将本项目鉴定到的所有代谢物(合并正、负离子鉴定到的代谢物)分为8类进行统计，各类代谢物数量及所占比例如图3B，C所示。脂质和类脂质分子、有机酸及其衍生物类别的代谢物数量最多，约占关节滑液总代谢物含量的50%，其中脂质和类脂质分子含量占比30.2%，有机酸及其衍生物含量占比19.9%。另外，还鉴定到关节滑液中含有10.1%有机杂环化合物、9.6%苯环烃类、6.9%有机氧化合物、4.3%苯丙烷和聚酮类、2.7%有机氮化合物、2.7%核苷及核苷类似物和13.5%其他化合物。每类代谢产物在幼年雌、雄犬和成年雌、雄犬关节滑液样品中的检出丰度如图3D所示。

2.4 雄性比格犬幼年与成年时期关节的代谢差异

单独比较雄性幼年犬和成年犬的关节滑液的代谢组学特征(图4)。在正、负离子模式下，分别建立OPLS-DA模型，从图4A中可以发现两组样品分别紧密聚集到一起，并得到了明显分离，说明两组样本中的内源性代谢物图谱存在显著性差异(图4A)。为了避免有监督模型在建模过程中发生过拟合，我们采用置换检验(Permutation test)进行检验，以保证模型的有效性。置换检验使用交叉验证的两个参数R2和Q2进行评价(R2表示模型的方差大小和拟合的优良度，Q2表示模型预测值的方差大小和预测能力)。正离子模式下OPLS-DA置换检验显示R2Y等于0.898，Q2等于0.676；负离子模式下显示R2Y为0.97，Q2为0.625，说明模型不存在过拟合现象，具有良好的稳健性和预测能力(图4B)。

雄性犬关节滑液代谢组学共鉴定出386种代谢物在幼年犬与成年犬中显著不同(VIP>1,P<0.05)。与幼年犬相比，成年犬关节滑液中有93个代谢物的含量显著增加，293个代谢物含量显著减少(图4C)。含量水平升高的内源性代谢物中，(+)-3-(3,4-亚甲二氧基苯基)-1,2-丙二醇的VIP值最大，其次是异丁酰甘氨酸、高瓜氨酸、白三烯 C4、3-甲氧基-4-羟基苯基乙二醇硫酸盐和假尿苷等。浓度降低的内源性代谢物中，L-哌可酸的VIP值最大，其次是脯氨酸甜菜碱、N(6)-甲基赖氨酸、7-甲基鸟苷和1-甲基组胺(图4D)。通路富集分析表明，差异代谢物主要参与组氨酸代谢、精氨酸生物合成、嘧啶代谢、ABC转运体、D-氨基酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、GABA突触信号通路等生理过程(图4E)。

注：A.OPLS-DA模型得分图;B.OPLS-DA模型置换检验图；图中横坐标表示置换保留度，即与原模型 Y 变量顺序一致的比例，纵坐标表示R2和Q2的值。绿色的点表示R2，蓝色的点表示Q2;C.正负离子模式火山图;D.显著性差异代谢物表达差异柱状图;E.KEGG通路富集分析图

2.5 雌性比格犬幼年与成年时期关节的代谢差异

雌性幼年犬和成年犬的关节滑液的代谢组学特征见图5。正、负离子模式下，OPLS-DA模型判别显示幼年组和成年组样本具有高质量的区分度，说明内源性代谢物图谱差异明显(图5A)。模型置换检验显示正离子模式下R2Y等于0.977，Q2等于0.535；负离子模式下R2Y为0.927，Q2为0.593，说明模型拟合度与稳健性均良好(图5B)。

雌性犬关节滑液代谢组学共鉴定到269种代谢物在幼年犬与成年犬中显著不同(VIP>1,P<0.05)。与幼年犬相比，成年犬关节滑液中有143个代谢物的含量显著增加，126个代谢物含量显著减少(图5C)。含量水平升高的内源性代谢物中，5-磷酸吡哆醛的VIP值最大，其次是戊二酰肉碱、N-乙酰丝氨酸、假尿苷、谷氨酰胺和1-水杨酸葡糖苷酸等。浓度降低的内源性代谢物中，1-甲基腺苷的VIP值最大，其次是7-甲基鸟苷、穗花双黄酮、脯氨酸甜菜碱和7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)(图5D)。通路富集分析表明，差异代谢物主要参与嘧啶代谢、ABC转运体、D-氨基酸代谢、矿物质吸收、组氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、碳水化合物分解和吸收、蛋白分解和吸收、氨基酰tRAN生物合成的生理过程(图5E)。

2.6 雌性与雄性比格犬关节发育过程中关节滑液的代谢特征

将雌、雄性比格犬关节滑液中鉴定到的代谢产物进行联合分析发现，从幼年到成年过程中，在雌性和雄性中共同上调的代谢物有18种，包括顺式-乌头酸、α-酮戊二酸、乳清酸核苷-5-单磷酸、胸腺嘧啶等，雄性特异性上调的代谢物有24种，雌性特异性上调的代谢物有34种(图6A，B)。雌性和雄性中共同下调的代谢物有30种，包括1-甲基-L-组氨酸、2′-脱氧胞苷、胞嘧啶-5-三磷酸、D-麦芽糖等，雄性特异性下调的代谢物有73种，雌性特异性上调的代谢物有11种(图6C，D)。综上可以看出，从幼年到成年的发育过程中，雌性比格犬和雄性比格犬关节代谢的共同产物有48种，提示这些产物可能是关节发育的潜在标志物，精准的标志物确定有待进一步验证。

注：A、C.雌、雄性比格犬代谢物联合分析韦恩图；B.雌、雄性共同上调代谢物热图；D.雌、雄性共同下调代谢物热图

3 讨论

机体的基础代谢会随着生物体发育产生相应改变，从而引起小分子代谢物的种类、浓度、比例等发生变化，最终造成个体间代谢图谱的差异[8]。代谢组学通过分析生物样本中可以反映机体状况的小分子内源性代谢物，对发育进程进行整体评价[8]。本研究采用UHPLC-Q-TOF MS检测手段对比格犬关节滑液进行测定，以代谢组学为分析途径，研究犬关节发育过程中的代谢特征。结果表明，雄性比格犬关节发育过程中，组氨酸代谢、精氨酸合成、ABC转运、蛋白质分解和吸收、矿物质吸收等过程产生的代谢物减少；雌性比格犬中参与ABC转运、组氨酸代谢、碳水化合物分解和吸收过程的代谢物减少，说明幼年比格犬骨关节代谢氨基酸、蛋白质、矿物质及碳水化合物的能力旺盛。此外，我们还发现比格犬关节发育过程中有48种代谢物含量发生显著性改变，可能是犬关节发育的生物标志物。

骨骼由骨基质和骨矿质组成，骨基质主要由氨基酸构成，其对骨骼的形态、大小和柔韧度起到决定性作用；骨矿质主要由钙构成，影响骨骼的致密度和坚硬度[9]。氨基酸是各种矿物质和微量元素的“搬运工”，钙、铁、锌、硒等各种矿物质和微量元素需要氨基酸和蛋白质将它们搬送到机体各处[10]。氨基酸除了具有促进骨骼发育的作用，还有保护骨骼的功能。例如，精氨酸代谢生成的NO能缓解炎性反应与风湿症，对肌腱、关节的炎症和疼痛具有消炎、缓解以及修复受损细胞与组织的功效[11]；组氨酸代谢能够有效防治类风湿性关节炎[12]。

骨骼中70%～80%的有机物属于胶原蛋白，胶原蛋白有助于骨骼及软骨的生长，保持骨骼和肌肉的弹性[13]。补充胶原蛋白可以促进关节润滑、防震、减少关节软骨磨损，从而延缓关节退行性改变，减轻临床不适症状等[14]。

碳水化合物是机体主要的供能物质，不可缺少。优质的碳水化合物对机体有保护和促进作用，如体质量控制、代谢健康、消化道健康等[15]。但也有研究认为饮食中的碳水化合物会引起骨质疏松、骨关节炎等疾病[16]。然而，并不是不摄入碳水化合物才是健康的模式，而是提倡摄入平衡的碳水化合物，可以通过饮食中碳水化合物、膳食纤维、糖的比例，来判断饲粮是否含有健康的碳水化合物[17]。

综上，通过对犬关节滑液的代谢组学研究，系统揭示了犬关节代谢的特征，以便针对性地对幼年犬和成年犬的饲粮营养配比进行优化，有助于幼年犬关节正常发育和成年犬的关节养护。