杜梨PbGID1家族基因克隆、CRISPR/Cas9载体构建及遗传转化

宋平丽，李 刚，许建锋，马青翠，亓宝秀，2，张玉星

(1.河北农业大学 园艺学院，河北 保定 071000；2.利物浦约翰摩尔斯大学，利物浦 L3 3AF)

赤霉素(Gibberellin，GA)是植物生长发育过程中起重要作用的一种植物激素。GA信号的转导过程主要是通过形成GA-GID1(Gibberellin insensitive dwarf 1)复合体后再与DELLA结合，诱导DELLA被泛素化降解，从而解除DELLA的阻遏作用，引起下游基因的表达，导致GA反应[1]。其中赤霉素受体GID1是赤霉素信号转导途径中与赤霉素特异性结合的关键蛋白，是植物感知赤霉素信号所必需的受体蛋白，对GA信号转导起重要作用[2]。

2005年GID1基因首次在水稻GA不敏感的矮化突变体gid1中被鉴定出来[2]。2006年，研究人员在拟南芥基因组中鉴定出3个水稻GID1的同源基因，分别是AtGID1a、AtGID1b和AtGID1c，单基因突变均不会引起矮化表型，但是三突却表现出GA不敏感的极矮化表型，证明它们功能冗余[3-4]。Hollender等[5]发现，桃树(Prunuspersica)发育迟缓性侏儒症(Brachytic dwarfism trait)是由于赤霉素受体PpeGID1c无义突变造成的，且改变GID1c的表达可以在不影响果实发育的情况下控制树体大小。随着生物技术的不断发展，赤霉素受体GID1基因已相继从杨树[6]、棉花[7]、茶树[8]、甘蓝型油菜[9]、板栗[10]、葡萄[11]等物种中成功分离和表达。

CRISPR/Cas9 技术自2013年被发现以来，迅速被国际生物界关注并应用，已经成为基因组定点编辑的首选方法。目前，在园艺植物上也获得了一些成功案例[12]。Illouz-Eliaz等[13]针对番茄中存在的3个GID1，通过CRISPR/Cas9技术构建了单突、双突和三突，发现在适宜生长条件下，只有三突(gid1TRI)长势弱小，叶色黑绿，而单突却没有明显的表型，证明3个GA受体在适宜条件下功能冗余。以上研究也为CRISPR编辑技术在其他植物进行GID1基因编辑提供了重要参考。

杜梨以其抗性强，适应性广，与梨品种嫁接亲和力强等优点，成为我国北方应用最为广泛的砧木[14]。由于其生长势强，嫁接品种后树体高大，给梨树矮化密植栽培带来较大的困难。本研究以杜梨为试材，通过克隆PbGID1家族基因，分析其氨基酸序列，设计相关突变关键靶位点，构建一套可同时编辑PbGID1家族基因的CRISPR/Cas9载体，转化至杜梨子叶并再生出阳性植株，旨在为将来获得矮化杜梨砧木提供理论和技术参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验所用杜梨叶片取自河北农业大学梨工程技术研究中心杜梨资源圃，液氮速冻后，-80 ℃冰箱保存。

试剂及菌株：PrimeSTAR®Max DNA Polymerase高保真DNA聚合酶和T4DNA连接酶订购于TaKaRa公司，BsaⅠ-HF购自New England Biolabs(NEB)公司，大肠杆菌感受态细胞DH5α和pEASY-Blunt Zero Cloning Kit克隆载体购自北京全式金生物，KOD-Plus高保真酶订购于东洋纺生物科技有限公司，DNA纯化和胶回收试剂盒、引物合成和其他试剂均订购于上海生工生物工程技术服务公司。植物表达载体pYLCRISPR/Cas9P35S-N和CRISPR/Cas9中间载体pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU6-1、pYLgRNA-AtU6-29均由华南农业大学刘耀光教授课题组提供[15]。农杆菌感受态EHA105为河北农业大学梨工程技术研究中心保存。

1.2 杜梨总RNA提取、cDNA合成和基因组DNA提取

杜梨总RNA提取参照TIANGEN RNA prep Pure Plant Kit提供的方法(天根生化科技有限公司)；cDNA合成参照TIANGEN FastKing cDNA第一链合成试剂盒提供的方法(天根生化科技有限公司)；gDNA采用M5 HiPer Plus多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒提取(北京聚合美生物科技有限公司)。

1.3 基因结构及氨基酸序列分析

根据杜梨测序基因组数据库数据，利用拟南芥AtGID1基因序列进行同源搜索，针对搜索的序列设计相关克隆引物(表1)。分别以杜梨cDNA和gDNA为模板扩增PbGID1家族基因。扩增程序为：95 ℃预变性2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 延伸 2 min。PCR产物进行胶回收后，连接至pEASY-Blunt Zero Cloning Kit克隆载体，转化大肠杆菌感受态DH5α中，挑取单克隆测序。

利用GSDS(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn)在线软件[16]，对测序的cDNA序列和基因组DNA序列构建基因结构；采用ClustalW 2(https：// www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)进行多序列比对，并利用 GeneDoc软件对序列比对结果进行编辑并输出。

1.4 CRISPR/Cas9靶点设计及载体构建

根据克隆的杜梨PbGID1s基因序列，使用CRISPR-P v2.0(crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2.0/)在线软件寻找潜在靶位点。靶点序列应位于基因外显子区域且不跨越内含子；靶点序列尽量不要包含4个及以上连续的胸腺嘧啶T；根据靶点GC含量和位置选择潜在靶点，最终确定8个靶点T1～T8。

根据唐雨薇等[17]报道的方法进行载体构建，载体系统包含双元植物表达载体pYLCRISPR/Cas9P35S-N和针对8个靶点的sgRNA表达盒中间载体pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU6-1和pYLgRNA-AtU6-29。引物参照表2合成，共需要进行2轮PCR，第1轮PCR针对每一个靶点进行2个独立的反应，T1～T8的2个反应依次为：U-F/AtU3dT1(反应①)和gRT1/gR-R(反应②)；U-F/AtU3bT2(反应①)和gRT2/gR-R(反应②)；U-F/AtU6-1T3(反应①)和gRT3/gR-R(反应②)；U-F/AtU6-29T4(反应①)和gRT4/gR-R(反应②)；U-F/AtU3bT5(反应①)和gRT5/gR-R(反应②)；U-F/AtU6-1T6(反应①)和gRT6/gR-R(反应②)；U-F/AtU6-29T7(反应①)和gRT7/gR-R(反应②)；U-F/AtU3dT8(反应①)和gRT8/gR-R(反应②)；第2轮PCR取第1轮反应①和②的PCR产物混合为模板，用Pps-GGL/Pgs-GG2、Pps-GG2/Pgs-GG3、Pps-GG3/Pgs-GG4、Pps-GG4/Pgs-GG5、Pps-GG5/Pgs-GG6、Pps-GG6/Pgs-GG7、Pps-GG7/Pgs-GG8、Pps-GG8/Pgs-GGL扩增，PCR产物纯化回收，即获得相应的T1-gRNA至T8-sgRNA表达盒片段。

将双元载体pYLCRISPR/Cas9P35S-N质粒与8个sgRNA表达盒回收片段，按表3提供的试剂比例添加，采用酶切-连接方法进行构建，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α，以卡那霉素(Kanamycin，Kan)筛选阳性菌落，并挑取单克隆，利用SP-L2/SP-R-C特异引物检测目标条带大小，菌液测序后提取质粒并转化农杆菌EHA105备用。

表2 CRISPR/Cas9-PbGID1s 载体构建所需引物Tab.2 Primers for CRISPR/Cas9-PbGID1s vector construction

表3 表达载体构建体系Tab.3 Expression vector construction system

1.5 杜梨子叶浸染及遗传转化

杜梨子叶再生参照林静[18]的方法，遗传转化参照庞宏光[19]的方法，主要操作包括：杜梨种子消毒、子叶诱导愈伤培养、农杆菌介导的遗传转化、筛选培养基培养4个步骤。

阳性植株检测：将在筛选培养基上生长的抗性芽及对照正常培养40 d后，对抗性苗和对照植株进行编号，提取基因组DNA，根据表达载体序列设计特异引物VecF/VecR(表4)，凝胶成像后根据条带大小判断抗性苗是否为转基因阳性苗。

2 结果与分析

2.1 杜梨PbGID1s基因克隆

以杜梨cDNA和基因组DNA为底物进行PbGID1s的克隆，利用特异引物(表1)，克隆到杜梨PbGID1家族的4个成员，分别命名为PbGID1b-1、PbGID1b-2、PbGID1c-1和PbGID1c-2，如图1所示，PbGID1b-1、PbGID1b-2，PbGID1c-1和PbGID1c-2的CDS序列分别为1 041，1 041，1 095，1 035 bp，DNA全长分别为1 401，1 373，1 706，1 640 bp。基因结构分析发现，PbGID1s家族成员均含有2个外显和1个内含子(图1-C)。

2.2 PbGID1s氨基酸序列分析

对4个杜梨PbGID1s氨基酸序列进行比对发现(图2)，4个PbGID1蛋白中均存在激素敏感酯酶家族保守的HGG和GXSXG保守域。拟南芥AtGID1s蛋白序列包含13个与GA或 DELLA的结合区，N端至C端依次为TWVLIS、LDR、FFHGGSF、HS、IYD、YRR、DGW、GDSSGGNI、GNI、MF、LDGKYF、WYW和 GFY[20]，对PbGID1s的氨基酸序列分析发现，除PbGID1b-1蛋白LDR结构域中的D被E取代外，其他结合区序列一致。以上结果表明，杜梨4个PbGID1s蛋白均具有GID1家族特有的保守结构，且在GA信号转导中发挥重要功能的氨基酸结构域与模式植物高度相似，属于GID1家族成员。

表4 阳性植株检测引物Tab.4 Primers for detection of positive plantlets and gene editing effect

A、B.分别以杜梨cDNA(A)和gDNA(B)为模板的PCR电泳图。1.PbGID1c-1；2.PbGID1c-2；3.PbGID1b-1；4.PbGID1b-2。C.PbGID1s基因结构。A，B.Gel electrophoresis of PCR products amplified using cDNA(A)or gnomonic DNA(B)of Pyrus betulifolia as template.1.PbGID1c-1；2.PbGID1c-2；3.PbGID1b-1；4.PbGID1b-2.C.Gene structure of PbGID1s.

2.3 基因编辑打靶位点的设计

针对杜梨PbGID1家族的每个基因分别设计2～3个靶点，以此降低脱靶风险，且靶点位置应在保守结构域HGG、GXSXG或关键结合区域上游，使PbGID1s发生关键位点的缺失或突变，进而失去功能。PbGID1s靶点选择如图3所示，共设计8个靶点，其中靶点T2、T6靶向PbGID1c-1，T1靶向PbGID1c-2，T3靶向PbGID1c-1和PbGID1c-2；T7靶向PbGID1b-1，T4、T8靶向PbGID1b-2，T5靶向PbGID1b-1和PbGID1b-2。

2.4 sgRNA表达盒和PbGID1s基因编辑载体构建

sgRNA表达盒的构建采用2轮PCR的方法，第1轮PCR扩增结果如图4-A所示，靶点T1/T8、T2/T5、T3/T6和T4/T7分别以pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU6-1和pYLgRNA-AtU6-29为底物各进行2个反应，前后2段(前段用F表示，后段用R表示)PCR产物分别均为150/130 bp，400/130 bp，350/130 bp，370/130 bp左右。

右侧数字表示氨基酸位置。HSL家族的HGG和GXSXG保守域由星号标出；横线区域为GA或DELLA蛋白的结合位点。The numbers in the right indicate positions of the amino acid sequences of cDNA.The HGG and GXSXG conserved domains of the HSL family are marked by asterisks；the underlined regions are the binding sites for GA or DELLA proteins.

红色NGG代表PAM序列。NGG highlighted in red are PAMs.

第2轮PCR将含有靶点序列的2个PCR产物混合后共同作为底物，使2个片段叠加成一个表达盒，扩增结果如图4-B所示，其中携带T1、T2/T5、T3/T6、T4/T7和T8靶点序列的表达盒片段分别依次为288，532，488，503，289 bp，通过电泳检查8段产物大小均符合预期，测序后证明sgRNA表达盒构建成功。

将8个sgRNA表达盒按表4体系构建至载体后，通过对阳性单克隆的菌液测序发现在pYLCRISPR/Cas9P35S-N载体中包含数目不等的靶点序列，其中最多包含5个靶点，分别是T1、T5、T6、T7、T8(图4-C)，目标靶点与启动子在载体连接顺序为AtU3d+T1-AtU3b+T5-AtU6-1+T6-AtU6-29+T7-AtU3d+T8。该序列位于pYLCRISPR/Cas9P35S-N载体2个BsaⅠ酶切位点之间，以上结果证明成功将带有5个靶点的sgRNA表达盒构入CRISPR/Cas9载体序列当中，且能同时靶向PbGID1家族的4个基因。

A.第1轮PCR跑胶图；B.第2轮PCR跑胶图；C.重组质粒示意图。A.First round PCR electropherogram；B.Second round PCR electropherogram；C.Schematic diagram of plasmid recombination.

2.5 杜梨子叶遗传转化

将上述成功构入5个靶点的CRISPR/Cas9载体转化入农杆菌EHA105中用于浸染杜梨子叶，试验重复3次，分别对浸染子叶数目、抗性子叶数目、抗性芽数目、阳性苗数目进行统计，统计结果如表5所示：第1次试验共浸染杜梨子叶195粒，具有抗性芽的子叶为32粒，占总数的16.41%，每粒子叶再生抗性芽数目为2.01，阳性苗为10株；第2次试验共浸染杜梨子叶200粒，具有抗性芽的子叶为21粒，占总数的10.50%，每粒子叶再生抗性芽数目为2，阳性苗为8株；第3次试验浸染杜梨子叶200粒，具有抗性芽的子叶为33粒，占总数的16.50%，每粒子叶再生抗性芽数目为2.15，阳性苗15株。3次试验共计浸染595粒杜梨子叶，获得抗性芽176个，阳性植株33株，转化效率达到5.55%。对第2次试验结果中的抗性苗及对照苗提取基因组gDNA，用载体特异序列VecF和VecR(表4)为引物扩增，部分结果如图5所示，空载体序列(22)为1 750 bp左右；共筛选出8株阳性苗分别编号3、6、7、11、12、15、20、23，因将sgRNA表达盒构建入载体，使得PCR扩增片段为3 000 bp左右，以上结果证明该CRISPR/Cas9表达载体已成功转入杜梨基因组。

表5 杜梨遗传转化结果Tab.5 Genetic transformation result analysis of Pyrus betulifolia

1～21，23.部分转化植株；22.阳性对照(空载体)；24.未转化植株。1—21，23.Partially transformed plantlets；22.Positive control(empty vector)；24.Untransformed negative control plantlet.

3 结论与讨论

赤霉素受体蛋白GID1在GA信号转导途径中起重要作用，负调控因子DELLA蛋白阻遏GA信号，而GA-GID1-DELLA复合体的形成是阻遏蛋白DELLA被降解的前提[21]，并且该复合体的形成也会一定程度降低植物体内游走的DELLA蛋白含量，从而降低DELLA蛋白对植物生长的抑制作用[22]。Cheng等[23]发现，寿星桃作为一种对GA处理不敏感的矮化突变体就是因为PpGID1c的第191位氨基酸发生突变，导致其不能与DELLA发生互作引起的矮化。因此GID1功能丧失或改变，使其不能形成复合体，可能会抑制或阻遏GA信号转导途径，使植株出现对GA不敏感的矮生表型。本研究利用同源克隆方法克隆得到4个杜梨GID1家族基因，通过序列比对及保守结构分析推测该家族基因均符合GID1蛋白特征，可能对杜梨GA信号转导起重要作用。

CRISPR/Cas9 作为一种由sgRNA介导的基因编辑技术，能在全基因组水平有选择性地调控目的基因表达，通过特异性识别具有PAM序列的目标DNA序列，对特定的靶点进行高效编辑；CRISPR/Cas9可以同时对任意数量基因进行编辑，因其具有高效、精准和便捷等特点，已经逐渐发展成为研究基因功能及物种定向改造的常用工具。但是，受限于遗传转化体系的不成熟，在木本植物尤其是在梨树上的应用仍存在很大困难。杜梨作为实生砧木在梨树生产中具有重要作用，但是以杜梨为砧木的嫁接品种生长后期往往树体高大，不利于矮化密植栽培的应用。所以通过利用CRISPR基因编辑技术定向突变杜梨PbGID1s基因，使其获得矮生性状成为可能。目前，杨锋等[24]已经通过构建双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体，并利用农杆菌介导的遗传转化法，将GUS转基因红茄梨愈伤组织的GUS基因敲除。Pang等[25]利用CRISPR/Cas9编辑技术，通过农杆菌介导转化的方法敲除杜梨PbPAT14基因。本研究在以上研究结果的基础上，构建了含有5个靶点的CRISPR/Cas9编辑载体，并成功利用农杆菌介导的方式将该载体转入杜梨基因组，为杜梨遗传转化提供方法支持。

尽管经过多次尝试和改良，本研究中心将该表达载体成功转入杜梨子叶并获得阳性植株。但遗憾的是，通过对阳性植株PbGID1s基因靶点前后约200～300 bp区域克隆并测序发现阳性植株均未发生编辑事件。究其原因，可能与本研究选用载体的启动子非杜梨内源启动子而是拟南芥特异启动子有关。Charrier等[26]在苹果中，利用苹果内源启动子U3和U6改造的CRISPR载体编辑效率显著提高；Ren等[27]通过在葡萄中克隆本源启动子VvU3/U6启动sgRNA和UBQ2启动子启动Cas9蛋白后，也显著提高CRISPR/Cas9载体在葡萄中的编辑效率。所以针对以上问题，接下来河北省梨工程技术研究中心将围绕杜梨本源启动子改造CRISPR/Cas9载体进行研究，在完善遗传转化体系的基础上，为获得杜梨矮生资源提供保障。

本研究克隆了4个杜梨PbGID1基因家族成员，PbGID1b-1、PbGID1b-2、PbGID1c-1和PbGID1c-2，均由2个外显子和1个内含子组成，且PbGID1s的氨基酸序列均含有HGG和GXSXG特征保守结构域和能与GA、DELLA结合的关键序列，具有赤霉素受体功能；成功将含有5个靶点的sgRNA表达盒构建至CRISPR/Cas9基因编辑载体，并可同时靶向PbGID1家族的4个基因；利用农杆菌EHA105介导，将CRISPR/Cas9-PbGID1s基因编辑载体转入杜梨子叶，成功再生出阳性植株。