棉花WRKY7基因克隆及其对黄萎病抗性分析

曾焱明，胡 广，贾 培，唐 叶，王炳婷，武 盼，陆承哲，陈爱民，彭清忠，吴家和

(1.吉首大学 生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000；2.中国科学院 微生物研究所，植物基因组学国家重点实验室，北京 100101；3.九圣禾种业股份有限公司,农业农村部西北内陆棉花品种创制重点实验室，新疆 昌吉 831100)

植物在漫长的发育历史中，进化出了应对一系列生物胁迫和环境胁迫的机制。例如，通过结构形态变化防治病害侵入组织结构抗性[1]；植物相关组织在病原菌入侵时，通过合成植保素来提高植物抗病性的生理生化抗性[2]；植物防御病原菌入侵及其他损伤因子危害时，通过水杨酸(Salicylic acid，SA)、茉莉酸(Jasmonic acid，JA)等植物激素及其介导的信号通路参与防御反应的植物激素介导的抗性[3]；通过病原物模式分子引发的免疫反应(PAMP-triggered immunity，PTI)和效应分子引发的免疫反应 (Effector-triggered immunity，ETI)来抵御病原菌侵害的抗病基因介导的抗性[4]。

转录因子(Transcription factor，TF)通过与真核基因启动子区域的顺式作用元件特异结合，从而激活或抑制下游基因的转录。这些转录因子主要包括WRKY、MYB、NAC、bZIP等。其中WRKY是植物特有的一个转录因子大家族，通常由1～2个保守WRKY结构域构成，该结构域的N端为WRKYGQK序列，C端为(C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H或C-X7-C-X23-H-X1-C)锌指结构。根据WRKY结构域的数量和锌指结构的特征，可以分为Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类[5-6]。WRKY一般与靶基因启动子区的W-box元件序列(T)TGAC(C/T)结合，进而调控下游基因的转录[7-8]。

植物WRKY在受到病原菌等刺激时能够快速表达，调控下游抗病基因的表达，在生物抗病性方面具有十分关键的作用。在拟南芥中，有许多WRKY转录因子编码基因都受到病原菌和抗病激素诱导，主要包括AtWRKY3、AtWRKY4、AtWRKY18、AtWRKY22、AtWRKY27、AtWRKY28、AtWRKY29、AtWRKY30、AtWRKY33、AtWRKY38、AtWRKY40、AtWRKY46、AtWRKY48、AtWRKY53、AtWRKY58、AtWRKY62、AtWRKY70等转录因子编码基因[8-10]。在水稻中，同样存在不少WRKY基因响应病原菌诱导，如：OsWRKY7、OsWRKY10、OsWRKY11、OsWRKY17、OsWRKY28、OsWRKY30、OsWRKY32、OsWRKY45、OsWRKY62、OsWRKY64、OsWRKY70、OsWRKY76、OsWRKY82等[11-14]。在棉花中也有一些抗病相关的WRKY报道[15-19]，但是棉花中抗病WRKY蛋白仍有许多没有进行研究。因此，探究棉花中WRKY转录因子的抗病性研究有着重要的理论和实际应用价值。

黄萎病作为影响棉花产量和质量的主要病害，有“棉花癌症”的俗称。我国的黄萎病病原菌主要为大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)，是一种土传性、植物维管束病害。由于大丽轮枝菌具有复杂、存活时间长、寄生在植物维管束内等特征，因此，目前对其防治手段有限，防治效果不理想。培育抗病品种被认为是防治黄萎病最适宜的方法，因此，克隆和鉴定抗病基因成为当前抗病育种培育的主要手段。本研究从陆地棉(Gossypiumhirsutum)中分离一个抗病相关的转录因子WRKY编码基因，命名为GhWRKY7。GhWRKY7蛋白定位在细胞核内，受到大丽轮枝菌和抗病激素SA和JA的诱导，GhWRKY7在棉花叶和根中表达明显高于茎秆中；当黄萎病菌侵染棉花时，GhWRKY7沉默植株对大丽轮枝菌抗性明显低于对照，且其棉花抗病标记基因PR1、PR3、PR4、PR5、PDF1.2、PAL1和CYP71B36表达显著下调。进一步研究揭示GhWRKY7基因能够转录激活GhCYP71B36的表达，促进植保素Camalexin的合成。结果表明，GhWRKY7基因调控如植保素Camalexin合成等相关下游基因的表达，提高棉花植株对大丽轮枝菌的抗性。

1 材料和方法

1.1 试验材料

陆地棉材料为中棉所35号和本氏烟草(Nicotianabenthamiana)，保存于中国科学院微生物研究所植物基因组学国家重点实验室。

大肠杆菌菌株(Escherichiacoli)DH5α、根癌农杆菌菌株(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101、大丽轮枝菌菌株V991都由本实验室保存。

烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus，TRV)载体：pYL-156(阴性对照载体)、pYL-156-PDS(阳性对照载体)和pYL-192(辅助载体)以及pCAMBIA1302-GFP载体、pBI121-GUS载体均保存于本实验室。

植物RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒和Master qPCR Mix(SYBR Green Ⅰ with UDG)试剂盒均购自北京擎科生物科技有限公司；各种限制性内切酶及其相关Buffer试剂购自宝日医生物技术(北京)有限公司；基因片段克隆PCR反应所需试剂和反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；PCR产物纯化回收试剂盒及PCR切胶回收试剂盒购自Omega Bio-Tek；DNA连接酶相关试剂购自南京诺唯赞医疗科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 抗病WRKY序列比对分析及进化树构建 根据文献报道，从拟南芥基因库(https：//www.arabidopsis.org/index.jsp)和水稻基因库(https：//ricedata.cn/gene/)中下载抗病相关WRKY氨基酸序列。将下载的抗病AtWRKY和抗病OsWRKY与陆地棉植株中克隆的一个抗病基因GhWRKY7(Gh_D05G2499)编码蛋白进行氨基酸序列比对，使用MAGE 5.2软件生成系统进化树，在线iTOL(https://itol.embl.de/)对进化树进行修饰。

1.2.2 植物材料培育 浓硫酸脱绒后，选取颗粒饱满、品相相当的棉花种子浸泡于水中，37 ℃过夜。转移种子至湿纸巾内，潮湿黑暗室温环境下萌发。待种子根部长至2～3 cm时，选取长势一致的幼苗，仔细去壳后种入混合土壤中(蛭石∶营养土=1∶1)，盖上保鲜膜，培养箱内培育(温度为25 ℃，照明为光照16 h / 黑暗8 h)；待种子根长达到3 cm左右时，选取长势相当的幼苗，去壳后转到水培盒中，盒内加入B5营养液(每7 d换1次)，并附上保鲜膜，放入培养箱内培育，培育条件同土培，待子叶展开后，去掉保鲜膜。每天定时关注幼苗生长情况，确保植株正常生长以便用于试验需要。

将烟草种子撒在一个装有水分充足混合土壤(营养土 ∶蛭石=1∶1)的小花盆中，盖上保鲜膜放入培养箱中。

1.2.3 棉花RNA提取及逆转录cDNA合成 采集样品植株，立即液氮研磨。按试剂盒说明书操作，提取棉花总RNA并检测浓度，-80 ℃保存。cDNA合成参照试剂盒说明书进行逆转录，-20 ℃保存以备后续试验。

1.2.4 Quantitative Real-time-PCR 选优质逆转录cDNA为模板，设计目的基因特异引物(表1)。以棉花UBQ7作为内参基因，设计内参基因引物(表1)按照试剂说明书配制反应体系，设置运行程序。重复3次生物学试验，按2-ΔΔCt计算基因的相对表达量。

1.2.5 大丽轮枝菌的活化培育与接菌处理 将保存的大丽轮枝菌液涂布于PDA平板，28 ℃培养2～3 d。从平板上挑取菌丝，转接至察氏培养基中，28 ℃，200 r/min，3～4 d。纱布过滤菌丝后，显微镜下用血球计数板统计孢子数量(Spores)，稀释孢子液至1.0×106spores/mL。接菌处理：选取正常生长约14 d的水培棉花植株进行统一伤根处理后，将培养液换成大丽轮枝菌孢子液(1.0×106spores/mL)继续培养。在0，12，24，36，48 h分别取样进行GhWRKY7相对表达量分析。参照Zhang等[16]报道，对棉花植株进行接菌处理，重复3次生物学试验，分别在接菌21 d后，观察统计棉花发病株数和发病程度，并计算发病率和发病指数。

1.2.6 SA和JA激素处理 选取生长14 d左右长势相当的棉花植株，取浓度0.1 mol/L的水杨酸和茉莉酸溶液各10 mL，均匀喷洒至棉花真叶表面。在0，1.5，4，7，12，24 h分别取样，-80 ℃保存。

1.2.7 载体构建及农杆菌培养 以BamH Ⅰ和KpnⅠ为目标基因片段插入点，选取GhWRKY7基因特异性片段设计引物(表1)，并在引物前加入酶切位点及保护碱基，克隆回收该片段。对pYL-156载体和回收片段用BamHⅠ和KpnⅠ限制性内切酶37 ℃酶切2 h，纯化后的片段与线性载体进行连接反应，构建TRV病毒表达载体pYL-156-GhWRKY7。

pCAMBIA1302-GFP载体以NcoⅠ和SpeⅠ酶切位点与GhWRKY7基因片段连接，构建 pCAMBIA1302-GhWRKY7-GFP载体。pBI121-GUS载体以ScaⅠ和BamH Ⅰ双酶切处理，GhCYP71B36启动子(GhCYP71B36pro)替换35S启动子(35Spro)，构建报告载体pBI121-GhCYP71B36pro-GUS；以XbaⅠ和ScaⅠ双酶切处理，GhWRKY7替换GUS，构建表达载体pBI121-GhWRKY7。

将构建好的质粒转入大肠杆菌DH5α，涂布在含卡那霉素(50 mg/mL)抗性的LB固体培养基上，37 ℃过夜培养。挑选正常生长的单菌落进行测序鉴定，获得含GhWRKY7特异性片段的病毒表达载体。用电击法将构建好的质粒载体分别转入农杆菌GV3101，涂布在含卡那霉素(50 mg/mL)和利福平(25 mg/mL)抗性的LB固体培养基上，28 ℃培养1～2 d，挑选阳性克隆进行测序验证，成功转入农杆菌的菌液-80 ℃保存。

1.2.8 沉默植株培育 从-80 ℃取出构建成功的农杆菌，接种到含相应抗性的LB液体培养基中，28 ℃，200 r/min过夜培养。收集菌体后用MMA(0.01 mol/L MES，0.01 mol/L MgCl2，0.2 mol/L AS)混合液重选菌体，将OD600调至1.2。将含阳性对照、阴性对照和重组载体的农杆菌重悬液分别与辅助载体的农杆菌重悬液按1∶1等体积混合，室温黑暗静置2～3 h。

选取正常生长至两子叶完全展开且长势相当的棉花植株，用无菌注射器针头在棉花子叶下表皮划出伤口，注射静置好的混合菌液，至整片子叶被充分浸润，注射好的棉花植株黑暗避光生长12 h后，转入培养箱正常培育。

1.2.9 烟草瞬时表达 重悬菌液后，将OD600调至0.8，室温避光静置2～3 h。选取生长健康的烟草植株，用无菌注射器针头在无损叶片的下表皮划出伤口，注射静置好的菌液，黑暗避光12 h后，转入培养箱。

1.2.10 亚细胞定位分析 分别注射含pCAMBIA1302-GhWRKY7-GFP和pCAMBIA1302-GFP载体的农杆菌到烟草叶片24 h后，用激光共聚焦显微镜Leica SP8观察荧光结果。

1.2.11 GUS染色 将注射好的烟草叶片在24 h后剪下，浸泡在90%丙酮中，4 ℃过夜脱色。PBS缓冲液漂洗后，GUS染液避光37 ℃放置1～3 d，观察叶片染色情况，用70%乙醇漂洗染色成功的叶片，至叶片呈白色，便于观察试验结果并进行比较。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 结果与分析

2.1 生物信息学分析抗病WRKY蛋白

前期初步报道了8个棉花抗病相关WRKY蛋白对大丽轮枝菌响应情况[15]，拟对GhWRKY7的抗病性进行深入研究。将GhWRKY7蛋白序列与28个拟南芥抗病WRKY蛋白和25个水稻抗病WRKY蛋白进行序列比对，结果显示，抗病相关WRKY在Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类中均存在，GhWRKY7和AtWRKY7均属于Ⅱ类(图1)；有趣的是抗病相关WRKY蛋白在3个类型都存在，表明不同WRKY结构域数量和锌指结构类型都有可能参与其调控植物抗病响应。

2.2 GhWRKY7-GFP融合蛋白亚细胞定位

将GhWRKY7基因克隆并插入pCAMBIA1302-GFP植物表达载体(35S∶GFP)，得到pCAMBIA1302-GhWRKY7-GFP载体(35S∶GhWRKY7-GFP)，转化农杆菌进行烟草叶片瞬时表达分析，结果如图2所示，在激光共聚焦显微镜Leica SP8下观察到35S∶GhWRKY7-GFP仅在植物细胞核呈现明显的绿色荧光，细胞内其他部分没有荧光。对照35S∶GFP在烟草叶片细胞中也呈现正常绿色荧光，在细胞膜和细胞核中均有表达，该结果表明，GhWRKY7蛋白定位于植物细胞核中。

2.3 GhWRKY7组织特异性表达和接菌诱导表达分析

利用qPCR方法分析GhWRKY7在棉花的根、茎和叶器官中的相对表达量，结果表明，GhWRKY7虽然在3个组织部位均有表达，但是其在根与叶中的表达水平显著高于茎(图3-A)。在对大丽轮枝菌及水杨酸和茉莉酸抗病激素处理后，采集自不同时间点的棉花检测GhWRKY7表达，结果表明，GhWRKY7的相对表达量变化较大。从图3-B可以看出，相对于接菌0 h，GhWRKY7表达量在接菌后24，36，48 h呈现显著增加。表明GhWRKY7基因表达受大丽轮枝菌诱导响应，暗示其参与调控棉花抗大丽轮枝菌的抗性。在水杨酸处理后，GhWRKY7表达量与0 h相比，在1.5，4，7，12，24 h均上调，其中在12 h表达量达到最大值(图3-C)。在茉莉酸处理后，GhWRKY7表达量在1.5 h显著上升达到最大值(P<0.05)，此后到24 h其表达量虽有回落，但是仍然显著高于0 h表达量(P<0.05)(图3-D)。这些结果表明，GhWRKY7基因表达受水杨酸和茉莉酸抗病激素诱导，暗示其抗病性可能涉及水杨酸和茉莉酸抗病激素信号通路。

Ⅰ类由2个WRKY结构域和C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H锌指结构构成；Ⅱ类由1个WRKY结构域和C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H锌指结构构成；Ⅲ类由1个WRKY结构域和C-X7-C-X23-H-X1-C锌指结构构成。Group Ⅰ consists of two WRKY domains and a C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H zinc finger structure；Group Ⅱ composed of a WRKY domain and a C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H zinc finger structure；Group Ⅲ consists of a WRKY domain and a C-X7-C-X23-H-X1-C zinc finger structure.

A.35S∶GFP表达框示意图；B.35S∶ GhWRKY7-GFP表达框示意图；C.35S∶GhWRKY7-GFP和对照组35S∶GFP在激光共聚焦显微镜下细胞内分布。A.Schematic diagram of 35S∶GFP expression frame；B.Schematic diagram of 35S∶GhWRKY7-GFP expression frame；C.The distribution of 35S∶GhWRKY7-GFP and control 35S∶GFP under laser confocal microscope.

A.GhWRKY7组织表达分析；B.大丽轮枝菌对GhWRKY7诱导表达分析；C、D.SA和JA对GhWRKY7诱导表达分析。不同字母表示差异显著(P<0.05)。图4—6同。A.Tissue expression analysis of GhWRKY7；B.Induced expression analysis of GhWRKY7 by V.dahliae；C，D.Expression analysis of GhWRKY7 induced by SA and JA.The different alphabets stand for significant difference(P<0.05).The same as Fig.4—6.

2.4 GhWRKY7沉默植株对大丽轮枝菌的抗性下降

为了验证GhWRKY7是否参与调控棉花对大丽轮枝菌抗性，利用VIGS技术培育GhWRKY7基因沉默植株进一步分析GhWRKY7基因的抗病功能。利用TRV载体构建了GhWRKY7沉默载体(图4-A)。试验设置阳性对照pYL-156-PDS，当植株真叶出现明显白化现象时(图4-B)，表明TRV沉默系统在棉花中能够沉默内源基因的表达。此时，利用qPCR分析GhWRKY7在沉默植株中的相对表达量，结果表明，沉默植株中GhWRKY7基因的平均相对表达量下降了50%以上(图4-C)。

为进一步研究GhWRKY7的抗病功能，对GhWRKY7沉默植株接种大丽轮枝菌，观察抗病表型，结果显示，接菌21 d后，GhWRKY7沉默植株(TRV∶GhWRKY7)叶片发黄、萎蔫脱落现象等病征明显高于对照组(TRV∶00，图5-A)。TRV∶GhWRKY7植株的发病高达94.44%，而对照组为83.33%；试验组病情指数达76.04，对照组为58.33(图5-B，C)。为进一步确认大丽轮枝菌对沉默植株的浸染，将发病植株和未接菌植株的棉花主茎秆进行切面分析，观察维管束褐化情况，结果表明，TRV∶GhWRKY7植株维管束褐化程度明显高于对照组，而未接菌的棉花茎组织的维管束没有褐化现象(图5-D)。发病植株茎段的病菌恢复培养结果显示，沉默植株的病原菌菌落数明显高于对照组(图5-E)。综上所述，这些结果表明，GhWRKY7基因正调控棉花对大丽轮枝菌的抗性。

2.5 GhWRKY7参与棉花抗病性涉及SA和JA信号通路

通过前面试验表明，GhWRKY7基因表达响应SA和JA激素的诱导(图3-C、D)。利用qPCR技术检测沉默植株接菌21 d后，检测SA和JA抗病标志基因表达水平；3个SA相关基因GhPR1、GhPR5和GhPAL1表达水平在GhWRKY7基因沉默植株中显著下降；3个JA相关基因GhPR3、GhPR4和GhPDF1.2及植保素(Camalexin)合成相关基因GhCYP71B36表达在沉默植株中也呈显著下降水平(P<0.05)。结果表明，GhWRKY7沉默严重降低了7个抗病基因的表达(图6)，进一步表明了GhWRKY7参与植株抗病性调控可能涉及SA和JA信号转导通路。

2.6 GhWRKY7促进GhCYP71B36转录表达提高棉花抗病性

细胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)编码基因在植物基因组中比例高达1%，在植物化学物质的生物合成途径中必不可少，有助于植物应对生物胁迫和环境胁迫时的化学防御机制[20]，其中CYP71是植物P450中最大的集团。据文献[21-22]报道，AtWRKY33能转录激活AtCYP71B15(PAD3)的

A.pYL-156-GhWRKY7沉默载体构建示意图，其中包含强启动子(35Spro)、NOSter终止子序列和用于各种目的基因片段构建的多克隆位点(Multiple clone sites，MCS)，GhWRKY7基因特异性片段大小为300 bp；B.阳性植株叶片白化表型；C.阴性对照与沉默植株中GhWRKY7基因相对表达量分析。

A.GhWRKY7沉默植株与对照组发病表型；B.植株发病率；C.病情指数；D.接菌棉花主茎秆切面维管束表型：WT为未接菌正常发育棉花植株；TRV∶00和TRV∶GhWRKY7为对照和沉默植株接菌21 d后，发病植株的主茎秆切面表型；E.接菌植株茎段恢复培养后，大丽轮枝菌生长情况。

表达，从而促进植保素Camalexin的合成，提高植物抗病性。将AtCYP71B15基因序列在棉花基因库中进行Blast比对，获得棉花同源基因GhCYP71B36，经过前面的分析表明，沉默GhWRKY7植株在接菌状态下，降低了GhCYP71B36的表达水平(图6-C)。因此，本研究利用GUS报告系统来分析棉花WRKY7是否也激活GhCYP71B36表达。首先克隆了GhCYP71B36基因的启动子，分别构建相应的激发载体和报告载体(图7-A)。如图7-B所示，仅仅注射含GhCYP71B36pro-GUS重组质粒农杆菌的烟草叶片部分显示较浅的GUS蓝色，而GhCYP71B36pro-GUS在与GhWRKY7等量共注射的烟草叶片部分，GUS蓝色明显加深，说明GhWRKY7能促进GhCYP71B36转录，提高植保素Camalexin合成，从而提高棉花的抗病性。

A.GhWRKY7沉默植株与对照组中SA抗病标志基因相对表达量；B.JA抗病标志基因相对表达量；C.GhCYP71B36相对表达量。GhWRKY7沉默植株与对照组的表达量测定于大丽轮枝菌浸染后21 d。A.Relative expression levels of three SA marker genes in GhWRKY7-silenced plants and control plants; B. Relative expression levels of three JA marker genes；C.Relative expression levels of GhCYP71B36. GhWRKY7-silenced plants and control group infection with V.dahliae at 21 days were sampled.

A.pBI121-GhWRKY7表达载体与pBI121-GhCYP71B36pro-GUS报告载体构建示意图；B.左为烟草瞬时表达的GUS染色结果，右为烟草叶片各部分注射情况。阳性对照pBI121-GUS菌液。A.Schematic diagram of construction of pBI121-GhWRKY7 expression vector and pBI121-GhCYP71B36pro-GUS reporting vector；B.GUS staining results of transient expression of tobacco on the left，on the right is the injection of each part of tobacco leaf.Positive control pBI121-GUS bacterial solution.

3 结论与讨论

本研究从陆地棉中分离出了植物抗病基因GhWRKY7，通过构建TRV病毒载体，获得棉花GhWRKY7沉默植株并对其接种大丽轮枝菌，21 d后观察沉默植株与对照发病情况不同，对其抗病相关基因进行研究分析，验证了GhWRKY7基因在棉花中对抗大丽轮枝菌侵染起到正向调控作用；揭示了GhWRKY7受到SA和JA激素诱导参与棉花抗病；进一步分析GhWRKY7通过促进如GhCYP71B36的转录激活，提高植保素Camalexin合成，增强植株对黄萎病的抗性。

WRKY作为植物中特有的转录因子大家族，参与植物防卫反应的信号转导，在植物抗病中起到重要作用。本研究中，当GhWRKY7沉默时，SA相关基因GhPR1、GhPR5和GhPAL1表达水平显著下降，同时3个JA相关基因GhPR3、GhPR4和GhPDF1.2也呈显著下降水平。结果表明，GhWRKY7沉默严重降低了7个抗病基因的表达；同时，GhWRKY7表达也受到抗病激素SA和JA的诱导；结果揭示，棉花WRKY7通过调控抗病激素SA和JA相关的抗病基因表达，同时又受到SA和JA激素的诱导表达，来影响植株对大丽轮枝菌的抗性。在其他植物中也有类似的报道，如SA诱导提高甘蔗WRKY5的表达，从而调节对青枯病镰刀菌的抗性[23]。在番茄里，SA上调SlWRKY8的表达，过表达SlWRKY8提高植株对丁香假单胞菌的抗性[24]。Kuki等[25]从小麦分离出4个WRKY转录因子TaWRKY49、TaWRKY92、TaWRKY112和TaWRKY142，都能诱导SA标志基因PR1的过表达，其中TaWRKY142同时诱导JA标志基因PDF1.2表达。在拟南芥中，抑制AtWRKY70表达会激活JA途径中COI1基因表达，AtWRKY70过表达会提高对SA介导的白粉病菌抗性，同时降低对JA介导黑斑病菌的抗性等[26]。由此可见，GhWRKY7和一些报道WRKY转录因子都是通过参与激活或抑制SA和JA途径来提高植株对病原菌的抗性。

本研究发现，沉默GhWRKY7能够显著降低植保素合成的关键基因GhCYP71B36的表达。通过该基因的启动子进行细胞内转录激活分析显示，GhWRKY7能够促进GhCYP71B36表达，提高植保素Camalexin合成，从而提高棉花对大丽轮枝菌的抗性。在拟南芥中，WRKY33在磷酸化修饰后能够转录激活AtCYP71B15(PAD3)的表达，促进植保素Camalexin的合成，提高植株的抗病性[21-22]。由此可见，GhWRKY7可能也是通过磷酸化修饰途径来调控GhCYP71B36表达，从而促进植保素Camalexin的合成；关于GhWRKY7磷酸化修饰功能的转变值得进一步研究。

本研究揭示GhWRKY7基因表达受到大丽轮枝菌入侵和抗病激素JA和SA诱导表达；沉默该基因显著降低了植株的抗病性。GhWRKY7蛋白定位在细胞核中，能够激活CYP71B36转录，促进植保素Camalexin合成，提高植株对大丽轮枝菌的抗性。作为棉花防卫途径中重要的调控蛋白，GhWRKY7可以作为棉花育种候选基因来培育棉花抗病新品种，保障棉花的安全生产。