Card9与肠道疾病相关性的研究进展

纪昌学 杨志文

1上海市松江区中心医院血管介入科，上海 201600；2上海市松江区中心医院药剂科，上海 201600

胱天蛋白酶募集域蛋白9（caspase recruitment domain containing protein 9，Card9）是机体的一种重要免疫炎性蛋白，主要分布于抗原提呈细胞，如巨噬细胞和树突状细胞。Card9活化后，激活下游核因子（NF）-κB、MAPK信号通路，释 放 大 量 白 细 胞 介 素（IL）-6、IL-1β、肿 瘤 坏 死 因 子（TNF）-α等炎症因子，在感染性疾病，尤其真菌感染中起着重要的免疫保护作用。目前，已有大量文献报道Card9在炎性肠病、结肠炎癌变、结肠癌的发生发展中起着至关重要的作用［1］。因此，本文拟对Card9在炎性肠病、结肠炎癌变、结肠癌中的研究进展进行阐述，为Card9靶向治疗的肠道疾病提供理论依据。

Card9在肠道中的表达情况及其作用

先天免疫细胞通过模式识别受体（pattern recognition receptors，PRR）特异识别病原微生物，激发机体免疫应答，从而清除和消灭入侵细菌、真菌、病毒等致病菌。已知，PRR主要有4类，C型凝集素受体（C-type lectin receptors，CLR）、Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）、RIG-I样受体（RIG-I like receptors，RLR）和核苷酸结合寡聚化结构域样受体（nucleotide binding oligomerzation domain，NOD）。已证实，Card9作为关键的传感器，参与CLR、TLR、NOD介导信号通路：细胞膜表面受体CLR激活后，活化定位在细胞质中的Card9，从而激活炎症介质NF-κB，存在CLR-Card9-NFκB信号通路参与宿主真菌感染的反应［2］；细胞膜表面受体TLR激活后，活化定位在细胞质中的Card9，从而激活炎症介质p38，存在TLR-Card9-p38信号通路参与宿主细菌感染的反应［3］；细胞内受体NOD激活后，活化定位在细胞质中的Card9，从而激活炎症介质p38，存在NOD-Card9-p38信号通路参与宿主细菌感染的反应［3］。

肠道微生态系统由肠道正常菌群及其所生活的环境共同构成，肠道微生物量占人体总微生物量的78%，肠道菌种类超过1 000种，其组成成分极为复杂，包括多种细菌、真菌、古细胞甚至一些病毒，肠道微生态平衡对人类抵抗肠道病原菌引起的感染性疾病非常重要。Card9能够识别肠道微生物，从而参与维持肠道微生态平衡［4-5］。Malik等［4］报道了Card9基因敲除小鼠肠道真菌种类变化，与野生型小鼠相比，Card9基因敲除小鼠肠道酵母菌的数量增加，而子囊菌的数量减少；Lamas等［5］报道了Card9基因敲除小鼠真菌特征变化，在第7天肠道真菌负荷达到高峰，且接合菌、担子菌、子囊菌等真菌作为肠道真菌群的主要组成部分。Malik等［4］发现了Card9基因敲除小鼠肠道的支原体、类杆菌、厌氧菌和里研菌等细菌的数量明显增加，而α-变形菌、螺杆菌、普雷沃氏菌、瘤胃球菌、帕拉普氏菌和大肠杆菌等细菌的数量明显减少。Lamas等［5］在Card9基因敲除小鼠的粪便中进一步证实了瘤胃球菌的数量明显减少。此外，Card9基因敲除小鼠肠道的色氨酸代谢所需微生物群数量明显减少，如阿洛巴氏菌和罗特乳酸杆菌。由于色氨酸代谢所需微生物缺失，导致肠道色氨酸代谢的芳基烃受体易感性降低，最终抑制Card9基因敲除小鼠的色氨酸代谢，引起肠道功能紊乱［5］。

Card9存在于人体多种组织中，在脾、肝、胎盘、肺、淋巴组织、脑等组织中均有不同程度的表达。Yang等［6］收集10例结肠癌患者的组织标本，明确Card9在肠道组织细胞中的分布。结肠组织免疫组化结果显示，结肠癌旁组织中Card9蛋白低表达，但在结肠癌组织中Card9表达水平显著增加；Card9靶向分布于肿瘤浸润巨噬细胞，而在结肠癌细胞中不表达［6］。此外，Card9免疫组化表达水平与巨噬细胞密度呈正相关［6］：Card9在人结肠低分化转移癌细胞、人结肠中分化转移癌细胞、人结肠高分化转移癌细胞中的阳性率分别为（13.17±1.35）%、（4.04±0.52）%、（1.99±0.41）%，提示Card9在人结肠低分化转移癌细胞中表达最高；CD68（巨噬细胞标志物）标记的巨噬细胞在人结肠低分化转移癌细胞、人结肠中分化转移癌细胞、人结肠高分化转移癌细胞中的阳性率大约为14%、5%、2%，显示巨噬细胞在人结肠低分化转移癌细胞密度最高［6］。

Card9在炎性肠病中的作用

Card9主要包含2个功能区，一个位于N末端区，有7～98个氨基酸残基，具有凋亡等功能；另一个位于C末端区，有140～420个氨基酸残基，主要行使蛋白质寡聚化功能。已知，Card9的C端、N端、启动子区域存在20多个与疾病相关的单核苷酸多态性位点，如R18W、R70W、R101C、Q289、Q295、rs10870077、rs4077515、rs10781499等［7］。已证实某些特定Card9单核苷酸多态性位点影响炎性肠病的临床转归［7］，其作用机理归因于Card9单核苷酸多态性影响Card9表达水平或功能，导致炎症因子分泌上调或下调。

2008年Zhernakova等［8］对1 815例炎性肠病患者进行分析，发现Card9 rs10870077单核苷酸多态性（胞嘧啶C被鸟嘌呤G替代）为炎性肠病患者Ⅲ期的易感因素，可能通过影 响 了肠 道 微 生 物 的 免 疫应 答 。2012年Lee和Song［9］对968例炎性肠病患者进行了全基因组关联研究，Card9非编码区rs4077515（胞嘧啶C被胸腺嘧啶T替代）单核苷酸多态性为炎性肠病患者的危险因素，可能通过改变了肠道炎症微环境。2018年Imhann等［10］对313例炎性肠病患者进行分析，Card9 rs10781499（腺嘌呤A被鸟嘌呤G替代）被认为是炎性肠病的遗传高风险因素，Card9 rs10781499可影响肠道上皮细胞完整性、辅助T17细胞功能、肠道微生态。2012年Rivas等［11］对313例 炎 性 肠 病 患 者 进 行 分 析 ，Card9 rs141992399 G＞C是炎性肠病的保护性因素。同样，Card9 rs200735402 C＞T也显示了对炎性肠病的保护作用。这可能归因于Card9单核苷酸多态性影响Card9基因特定的外显子缺失，导致Card9某些转录和翻译受到限制，最终Card9蛋白生物活性的丢失，抑制肠道炎性反应［11］。综上，Card9 rs10870077 C＞G、Card9 rs4077515 C＞T、Card9 rs10781499 A＞G是炎性肠病患者的危险因素，而Card9 rs141992399 G＞C、Card9 rs200735402 C＞T是炎性肠病的保护因素。

值得注意的是，2015年Wang等［12］对288例中国人群炎性肠病患者进行分析，Card9 rs10870077 C＞G、Card9 rs10781499 A＞G与炎性肠病没有任何关联性，作者把这不一致的结果归因于东西方人类种族的差异。

此外，Cao等［13］报道一种新型的Card9激活机制参与肠道炎性反应：Card9的C端与TRIM62蛋白结合，形成Card9/TRIM62蛋白复合体，招募多泛素化蛋白K27，诱导Card9泛素化，释放大量炎症因子，而TRIM62基因敲除小鼠显著降低炎症因子分泌，减轻肠道炎性反应。小分子化合物BRD5529选择性地与Card9结合，破坏TRIM62募集，抑制TRIM62介导的Card9泛素化和激活［14］。

Card9在结肠炎癌变中的作用

结肠炎相关性结直肠癌（colitis-associated cancer，CAC）通常由炎性肠病发展而来，是炎性肠病较为严重的并发症，其癌变模式就是通过炎症-癌变途径发生的。研究表明，肠道菌群紊乱在CAC的发病机制中起着核心作用，其主要通过肠黏膜诱导异常免疫应答引发疾病［15］。

氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）/葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate，DSS）小鼠模型是致癌剂AOM和致炎剂DSS两者协同作用基础上，产生肠黏膜炎症损伤，由炎性肠病逐步发展为癌症，因为AOM/DSS小鼠模型能较好地模拟肠道炎癌变的生理病理过程，已广泛应用于CAC的研究［15］。

Wang等［16］发 现 在AOM/DSS诱 导 的 小 鼠 模 型 中 ，Card9基因敲除后，CAC瘤体大小和数量显著增加，提示Card9高表达能够抑制CAC的发生发展。研究进一步发现，Card9基因敲除小鼠抗真菌能力显著下降，导致肠道真菌种类和数量发生明显增加，而白色念珠菌成为数量最多的真菌。有证据表明，在Card9基因敲除小鼠中，由于白色念珠菌增加，从而诱导CAC的发生发展［16］。与此同时，抗真菌药物氟康唑可显著降低Card9基因敲除小鼠的白色念珠菌数量，有效降低瘤体大小和数量，改善CAC的预后。Card9参与CAC潜在的分子机制可能是，Card9基因敲除后，小鼠肠道巨噬细胞的杀菌能力受损，导致白色念珠菌在肠道成为优势菌群，诱导髓系来源抑制细胞（MDSCs）在肠道组织中的聚集，抑制机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和清除能力，最终促进CAC的发展［16］。Malik等［4］报道了相同的结果，Card9能够减少肠道真菌数量，抑制CAC的发生发展。已知，炎症小体是多聚体蛋白复合物，可激活半胱氨酸蛋白酶caspase-1，参与IL-18的蛋白水解过程［17］，而IL-18可保持肠道上皮细胞屏障完整性，并刺激肠CD8+T细胞产生干扰素-γ［18］。Card9基 因 敲 除 的CAC小 鼠 中 ，炎 性 小 体 和IL-18显著降低［16］。Card9基因敲除小鼠给予Casp1+/+骨髓来源的髓样细胞以及外源性IL-18，可显著增加T细胞产生干扰素-γ，产生明显的抗肿瘤效果［16］。

然而，Bergmann等［19］报道Card9促进CAC的发生发展。与野生型小鼠相比，Card9基因敲除小鼠瘤体大小和重量明显降低。已知，Card9可诱导IL-1β分泌，从而激活IL-22介导的STAT3肿瘤信号通路［20］。Card9基因敲除的CAC小鼠中，下调IL-1β分泌，抑制肠道淋巴细胞IL-22表达，阻断肿瘤细胞STAT3信号通路，最终产生抗肿瘤效果［19］。

Card9在结肠癌的中的作用

2014年Yang等［6］对48例 结 肠 癌 患 者 研 究 发 现 ，Card9表达水平与临床病理组织特征具有显著的相关性：Card9表达水平与结肠癌分化程度负相关，低分化结肠肿瘤（12例）、中分化结肠肿瘤（29例）、高分化结肠肿瘤（7例）中的免疫组化Card9阳性率分别为（16.01±1.54）%、（6.44±0.52）%、（1.04±0.28）%（P＜0.05）；Card9表达水平与结肠癌浸润程度和转移、结节、复发率正相关，如T1（2例）、T2（6例）、T3（31例）、T4（9例）结肠浸润的Card9阳性率分别为（1.52±0.80）%、（3.35±1.40）%、（8.98±0.95）%、（12.41±2.94）%（P＜0.05），M0（45例）和M1（3例）远端 转 移的Card9阳 性 率 分 别 为（7.34±0.75）%、（23.05±3.60）%（P＜0.05）［6］。结肠癌患者肿瘤组织中的Card9 mRNA和蛋白水平远高于癌旁组织，其中Card9 mRNA水平大约高出4倍。巨噬细胞在正常组织中浸润数量较少，而在肿瘤组织中浸润数量明显增加，且M2极化标志物CD163也明显增加，提示肿瘤组织中浸润巨噬细胞M2极化，可促进结肠癌的发展发展［6］。此外，Card9异常表达的结肠癌患者极易发生肝脏转移，主要机制如下：促进肿瘤微环境中肿瘤细胞迁移；诱导巨噬细胞释放IL-6，IL-12，IL-10，转化生长因子（TGF）-β，血管内皮生长因子（VEGF）等肿瘤促进因子；激活NF-кB，诱导巨噬细胞M2极化［6］。

肠病相关T细胞淋巴瘤是一种罕见的人小肠原发性T细胞淋巴瘤［21］。Tomita等［21］收集20例来自日本的肠病相关T细胞淋巴瘤患者，采用寡核苷酸芯片和荧光原位杂交技术，发现这20例患者中15例的Card9异常表达（高达75%），提示Card9可能是肠病相关T细胞淋巴瘤的易感基因。Deleeuw等［22］也报道了类似的研究，Card9与肠病相关T细胞淋巴瘤相关，且未发现东西方人群中的种族差异。

展 望

Card9主要分布于巨噬细胞的胞浆中，能够激活NF-κB、MAPK炎症信号通路，释放和分泌炎症因子，在微生物感染中起着至关重要的作用。肠道微生态系统由肠道正常菌群及其所生活的环境共同构成，包括大量的细菌、真菌和病毒，这些微生物可特异性结合肠道巨噬细胞PRR，从而激活下游信号分子Card9，存在Card9参与炎性肠病、结肠炎癌变、结肠癌的发生发展。

肠道微生物群较为复杂，且受多种因素影响，Card9在肠道疾病中的作用尚不完全清楚。本文在对Card9与肠道疾病相关性的综合分析，也发现不同学者观点也不一致：有研究显示Card9单核苷酸多态性是炎性肠病患者的危险因素，但另外一些研究发现Card9单核苷酸多态性是炎性肠病的保护因素；有研究表明Card9促进结肠炎癌变的发生发展，但另外一些研究发现Card9抑制结肠炎癌变的发生发展；临床研究显示Card9促进肿瘤作用，但在一些动物实验中显示Card9有抑制肿瘤作用。因此，需要学者进一步研究探索Card9在肠道疾病中的作用及其分子机制，明确Card9如何调控肠道微生物，阐明Card9在肠道疾病诊治方面的价值。