1-甲基环丙烯处理对采后紫背天葵抗氧化系统的影响

张 飞，石 洁，谢意通，姜 丽*

（南京农业大学食品科学技术学院，江苏 南京 210095）

紫背天葵（Gynura bicolorDC.），也称红凤菜、观音菜、血皮菜等，富含花青素、类黄酮、维生素、氨基酸和多种微量元素等物质[1]，具有抗氧化、抗炎症、抗癌症[2-3]等活性。紫背天葵是一种集营养保健价值和特殊风味为一体的高档蔬菜，多用于鲜食[4]。但是采后紫背天葵容易出现感官品质和营养价值下降的问题，因此适当的采后保鲜技术对紫背天葵而言非常重要。

目前国内外应用到采后紫背天葵的保鲜方法主要有应用气调[4]、植酸[5]、1-甲基环丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）[6]、一氧化氮[7]和短波紫外线[8]等处理。1-MCP是一种无毒、无明显气味、稳定性好且作用浓度低的保鲜剂，在蔬菜和水果的保鲜中运用广泛，研究显示1-MCP处理对桃果实[9]、小青菜[10]、白菜[11]、羽衣甘蓝[12]等具有显著的保鲜效果。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是植物新陈代谢的重要产物，包括超氧阴离子、过氧化氢（H2O2）、单线态氧、羟自由基等[13]。正常环境下，植物细胞中ROS含量较低并维持着动态平衡；当植物衰老或受到胁迫时，ROS会大量积累并对生物分子如蛋白质、脂质等造成氧化损伤[14]。植物的抗氧化系统是维持ROS稳态水平的关键，主要分为两类，一类是非酶类抗氧化物质，包括多酚、花青素、生育酚、抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）等；另一类是抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶（superoxidase，SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）和过氧化物酶（peroxidase，POD）等[15]。姜丽[4]研究发现1-MCP处理能显著抑制冷藏期间紫背天葵的腐烂，延缓了花青素、叶绿素和总酚等物质含量的下降，并且能够提高抗氧化酶的活性；另外，Jiang Li等[6]结合蛋白组学技术发现1-MCP处理能够提高SOD和POD的蛋白质丰度；Xu Xin等[16]进一步对Cu/Zn SOD基因进行克隆分析，发现1-MCP能显著提高Cu/Zn SOD基因的相对表达量。但是1-MCP对于紫背天葵抗氧化系统的影响并非只在酶活力水平或单个酶的蛋白质和基因表达水平的调控，目前1-MCP对于抗氧化系统的影响还缺乏一个系统和完善的认知，同时1-MCP对抗氧化酶在转录水平的调控还不清楚。本实验旨在同时从抗氧化物质、抗氧化酶活性及其基因表达并结合两者相关性分析的角度来揭示1-MCP对采后紫背天葵的抗氧化系统的调控机理，为后续进一步研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫背天葵采自苏州润汇农业有限公司，无机械损伤和病虫害。

DL 2000 DNA Marker (3427A)、RNA prep Pure Plant Kit (RR9769)、PrimeScript™ RT Master Mix (RR047A)、SYBR®Premix Ex Taq™ (RR420A)试剂盒 宝生物工程（大连）有限公司；1-MCP粉末（纯度4.3%） 咸阳西秦生物科技有限公司；羟胺、过氧化氢 国药集团化学试剂有限公司；对氨基苯磺酸、α-萘胺、愈创木酚、核黄素、氮蓝四唑 北京索莱宝科技有限公司；氧化型谷胱甘肽（oxidizedg lutathione，GSSG）；还原型辅酶II、乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮 上海瑞永生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

CheckMate 3顶空分析仪 丹麦PBI Dansensor公司；NanoDrop 2000微量分光光度计 美国Thermo Fisher Scientific公司；ABI Quantstudio 5实时荧光定量分析仪、ABI 2720型热循环仪 美国Applied Biosystems公司；DYY-10C电泳仪 北京市六一仪器厂；Alpha-1860A紫外-可见分光光度计 上海谱元有限公司；HH-6数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；TGL16M台式高速冷冻离心机 长沙维尔康湘鹰离心机有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

将紫背天葵随机分为两组，将1.5 kg紫背天葵正向朝上整齐立在泡沫箱（55 L）底部，1-MCP处理组使用10 μL/L 1-MCP于（20±2）℃条件下密闭熏蒸6 h，具体操作为：称取28.5 mg 1-MCP粉末（纯度4.3%）于离心管中，加入30 mL蒸馏水后迅速放入泡沫箱中（置于紫背天葵上方）进行密闭熏蒸。对照组用同体积的蒸馏水作相同处理。每组处理设置3 个平行。熏蒸完毕后分装于食品保鲜袋（每袋500 g），在（20±2）℃、相对湿度80%～90%条件下贮藏7 d。分别于0、1、3、5、7 d取样并测定指标，每次随机抽取3 袋，取实验材料叶片的叶尖至1/3叶脉较少处，切碎并混合均匀，用液氮速冻处理后置于-80 ℃冰箱备用。

1.3.2 感官品质评分

参考李双芳等[17]方法略加修改对紫背天葵感官品质进行评定。从外观、质地、形态和紫背天葵特有的气味4 个方面进行综合评定，每项满分25 分，合计100 分，具体评分标准见表1。结果基于10 名评定员的感官评分计算平均值得出。

表1 紫背天葵感官品质评价标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of G.bicolor

1.3.3 呼吸强度测定

将300 g的紫背天葵样品放入玻璃密封罐，室温放置2 h后使用O2/CO2气体分析仪测定呼吸强度。单位为mg CO2/（kg·h）（本实验结果均以鲜质量计）。

1.3.4 超氧阴离子生成速率和H2O2含量测定

超氧阴离子生成速率、H2O2含量测定参照文献[9]，单位分别为nmol/（min·g）和mmol/g。

1.3.5 AsA和GSH含量测定

AsA含量和GSH含量测定参照文献[10]，单位均为mg/kg。

1.3.6 抗氧化酶活力测定

准确称量0.5 g样品，加入5 mL 50 mmol/L、pH 7.8的磷酸缓冲液（含0.1 mmol/L乙二胺四乙酸和质量分数2%聚乙烯吡咯烷酮，后同）并匀浆，低温振荡提取10 min，于4 ℃条件下10 000×g离心20 min，上清液用于SOD和GR活力测定。APX和CAT粗酶液的提取使用5 mL 50 mmol/L、pH 7.0的磷酸缓冲液，POD粗酶液的提取使用5 mL 50 mmol/L、pH 6.0的磷酸缓冲液，缓冲溶液均包含0.1 mmol/L乙二胺四乙酸和2% PVP，且其他提取步骤同SOD和GR活力测定。SOD、CAT和POD活力测定均参照文献[4]；APX和GR活力测定参照Fukuoka等[18]方法。SOD活力以体系每分钟抑制氮蓝四唑光化还原的50%所需要的酶量为一个酶活力单位（U），单位为U/g。分别定义每分钟A240nm、A290nm、A340nm、A460nm变化0.01为CAT、APX、GR、POD的一个酶活力单位（U），单位均为U/g。

1.3.7 RNA提取、cDNA合成和实时荧光定量聚合酶链式反应

参考RNA prep Pure Plant Kit说明书提取RNA。使用微量分光光度计测定RNA浓度，通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。使用PrimeScript™ RT Master Mix合成cDNA。根据三代加二代全长转录组学测序结果获得的基因序列，使用Oligo 7.0和Primer premier 5软件设计特异性引物（表2），并按照SYBR®Premix Ex Taq™试剂盒说明书配制体系并进行实时荧光定量多聚核苷酸链式反应，运行程序为：94 ℃、30 s；95 ℃、5 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30s，40 个循环。以Actin为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

表2 内参基因和目的基因的引物序列Table 2 Primer sequences used for reference and target gene amplification

1.4 数据处理和分析

实验结果以平均值±标准差表示，采用Excel 2019和SPSS 19.0软件对实验数据进行统计分析和相关性分析，采用Duncan多重比较法检验数据的差异显著性，P＜0.05表示差异显著。采用Origin 18.0软件和Visio 2019软件绘图。

2 结果与分析

2.1 1-MCP对紫背天葵感官品质的影响

感官评价是紫背天葵品质指标中最直观的项目，在贮藏第1天，两组紫背天葵间无显著差异，新鲜度很高，叶片平整饱满，色泽鲜艳有光泽感，带有特殊香味。贮藏1 d后，紫背天葵的感官品质均迅速下降，叶片出现褐变、卷曲甚至黄化腐烂等现象，但1-MCP处理显著延缓了紫背天葵感官品质的下降（P＜0.05）（图1）。

图1 1-MCP对紫背天葵感官品质的影响Fig.1 Effect of 1-MCP treatment on the sensory quality of G.bicolor

2.2 1-MCP处理对紫背天葵呼吸强度的影响

紫背天葵的呼吸强度在贮藏第1天迅速下降，之后随贮藏时间的延长缓慢下降（图2），1-MCP处理组的呼吸强度在第1天后一直显著低于对照组（P＜0.05）。

图2 采后1-MCP处理对紫背天葵呼吸强度的影响Fig.2 Effect of 1-MCP treatment on the respiration intensity of G.bicolor

2.3 1-MCP处理对紫背天葵超氧阴离子生成速率和H2O2含量的影响

紫背天葵的超氧阴离子生成速率随贮藏时间的延长逐渐增加（图3A）。对照组的H2O2含量呈持续上升的趋势，而1-MCP处理组的H2O2含量在第1天迅速达到峰值后开始下降直到贮藏期结束（图3B）。与对照组相比，1-MCP处理显著提高了第1天的超氧阴离子生成速率和H2O2含量，在第3天后反而显著降低了超氧阴离子生成速率和H2O2的积累（P＜0.05）。本实验说明1-MCP提高了贮藏前期的ROS水平，造成了氧化应激，但降低了后期ROS的积累，从而减少ROS对细胞的氧化损伤。

图3 采后1-MCP处理对紫背天葵叶片超氧阴离子生成速率（A）和H2O2含量（B）的影响Fig.3 Effect of 1-MCP treatment on superoxide anion production rate (A) and H2O2 content (B) in G.bicolor leaves

2.4 1-MCP处理对紫背天葵AsA和GSH含量的影响

对照组紫背天葵的AsA含量随贮藏时间的延长逐渐下降，1-MCP处理组在第1天AsA含量迅速下降随后上升（图4A）。除第1天外，1-MCP处理AsA含量始终高于对照组。紫背天葵的GSH含量在贮藏期间先上升后缓慢下降（图4B），1-MCP处理组和对照组分别在第3天和第5天达到峰值，1-MCP处理显著提高了前3 d的GSH含量（P＜0.05）。本实验说明1-MCP能够较好地保持AsA和GSH含量，有利于维持紫背天葵的高还原能力和抗氧化能力。

图4 采后1-MCP处理对紫背天葵叶片AsA（A）、GSH含量（B）的影响Fig.4 Effect of 1-MCP treatment on the contents of ascorbic acid (A)and glutathione (B) in G.bicolor leaves

2.5 1-MCP处理对紫背天葵SOD活力及其基因表达的影响

紫背天葵的SOD活力在第1天迅速上升并达到最大值，随后下降直到贮藏期结束，与对照组相比，1-MCP处理显著抑制了第3天后的SOD活力的下降（P＜0.05）（图5A）。与SOD活力不同，1-MCP处理提高了紫背天葵贮藏前期GbSOD的表达水平，而在后期显著下调了该基因的表达水平（P＜0.05）（图5B）。本实验证明，1-MCP处理提高了紫背天葵的SOD活力和贮藏前期的GbSOD的相对表达量，有利于ROS的清除并维持其动态平衡。

图5 采后1-MCP处理对紫背天葵叶片SOD活力（A）和GbSOD相对表达量（B）的影响Fig.5 Effect of 1-MCP treatment on SOD activity (A) and the relative expression of GbSOD (B) in G.bicolor leaves

2.6 1-MCP处理对紫背天葵APX和CAT活力及其基因表达的影响

贮藏期间紫背天葵APX和CAT活力及其基因相对表达量变化趋势如图6所示，1-MCP处理组的APX活力（图6A）和GbAPX1相对表达量（图6C）在贮藏期间总体呈先上升后下降的趋势，而对照组呈波动下降的趋势。APX活力和GbAPX1相对表达量显著相关（r＝0.75，P＜0.05）。与对照组相比，1-MCP处理显著提高了贮藏前期的APX活力和GbAPX表达量（P＜0.05），分别在第1天和第3天提高了54.7%和66.4%的APX活力以及43.5%和98.11%的GbAPX1相对表达量，但在贮藏后期对两者均无显著影响。

紫背天葵的CAT活力（图6B）和GbCAT相对表达量（图6D）显著相关（r＝0.82，P＜0.05），在贮藏期间均先上升后下降，并在第3天达到峰值。在贮藏期间，1-MCP组的CAT活力和GbCAT相对表达量高于对照组，但在第3天后差异才达到显著水平（P＜0.05）。本实验证明，1-MCP处理通过提高紫背天葵的GbAPX1和GbCAT的相对表达量，从而分别在贮藏前期和后期提高了APX和CAT的活力，维持了较高的抗氧化活性。

图6 采后1-MCP处理对紫背天葵叶片APX（A）和CAT（B）活力、GbAPX1（C）和GbCAT（D）相对表达量的影响Fig.6 Effect of 1-MCP treatment on the activity of APX (A) and CAT (B), and the relative expression of GbAPX1 (C) and GbCAT (D) in G.bicolor leaves

2.7 1-MCP处理对紫背天葵GR活力及其基因表达的影响

对照组紫背天葵的GR活力在贮藏期间持续下降，而1-MCP组的持续上升直到第3天达到峰值后才下降（图7A）。紫背天葵的GbGR相对表达量与GR活力显著相关（r＝0.75，P＜0.05）（图7B）。与对照组相比，1-MCP处理提高了紫背天葵贮藏期间的GR活力和GbGR相对表达量，尤其在第3天处理组的GR活力和GbGR相对表达量均为对照组的2 倍多。本实验表明，1-MCP处理刺激了紫背天葵叶片的GbGR表达并提高了GR活力，从而提高紫背天葵的抗氧化能力。

图7 采后1-MCP处理对紫背天葵叶片GR活力（A）和GbGR相对表达量（B）的影响Fig.7 Effect of 1-MCP treatment on GR activity (A) and the relative expression of GbGR (B) in G.bicolor leaves

2.8 1-MCP处理对紫背天葵POD活力及其基因表达的影响

紫背天葵的POD活力在贮藏期间呈先上升后下降的趋势，与对照组相比，1-MCP处理显著提高了紫背天葵第1天的POD活力，但在之后反而显著降低了POD活力（P＜0.05）（图8A）。此外，1-MCP处理也在第1天显著上调了紫背天葵叶片的GbPOD42相对表达量（P＜0.05），随后GbPOD42相对表达量迅速下调，3～7 d 1-MCP处理对其表达影响较小（图8B）。本实验证明，1-MCP处理在第1天迅速提高了POD活力和GbPOD42相对表达量，而在后期显著降低了POD的活力（P＜0.05）。

图8 采后1-MCP处理对紫背天葵叶片POD活力（A）和GbPOD42相对表达量（B）的影响Fig.8 Effect of 1-MCP treatment on peroxidase activity (A) and the relative expression of GbPOD42 (B) in G.bicolor leaves

3 讨 论

在贮藏过程中，紫背天葵会出现褐变暗沉、叶片卷曲、失水萎焉、黄化和腐烂等现象，导致感官品质下降，本实验中1-MCP能有效抑制紫背天葵感官品质的下降。呼吸强度是果蔬贮藏期间的重要指标。有氧呼吸代谢过程会产生ROS[19]，过高的呼吸强度会加速植物衰老。与1-MCP处理对韭菜[20]和茭白[19]的影响一样，1-MCP处理能降低紫背天葵的呼吸强度，从而减少营养物质的消耗。低浓度的ROS可以作为信号分子激活植物的防御途径，过多的ROS积累对细胞有毒性，会加速植物的衰老进程[13]。本实验中1-MCP处理在前期提高了超氧阴离子的生成速率和H2O2的含量，从而提高了紫背天葵的抗氧化和抗压能力，但在后期抑制了超氧阴离子和H2O2的积累以防止过高的ROS水平氧化细胞成分和破坏细胞结构，这与1-MCP处理小青菜的研究结果[9]一致。AsA和GSH是植物中的抗氧化剂，通过协同作用清除超氧阴离子和H2O2来保护不稳定的大分子免受攻击[21]。本研究中1-MCP能保持采后紫背天葵AsA和GSH的含量，这对于清除ROS并维持细胞稳态水平至关重要。

SOD作为植物防御体系的第一条线，能特异性地将超氧阴离子歧化为H2O2和O2。本实验证明1-MCP能提高SOD酶的活性从而减少超氧阴离子对植物的毒害作用，这与香菜的研究结果[22]一致。1-MCP在贮藏前期提高但在后期下调了GbSOD的相对表达量，这与1-MCP对苹果的Cu/Zn SOD基因的调控结果[23]一致。植物来源的SOD的表达与其生长发育阶段有关，当植物处于逆境胁迫时内源激素与ROS共同调节SOD的表达[24]，本实验中GbSOD相对表达量与H2O2含量显著相关（r＝0.83，P＜0.05），说明1-MCP通过提高或降低H2O2含量来调控GbSOD的相对表达量。转录水平的上升或下降并不完全代表酶活性的上升或下降，酶活性不仅受转录水平调控，还与转录后加工、翻译与翻译后修饰密切相关[25-26]。硝基化和S-谷胱甘肽化是SOD酶的两种翻译后修饰方式，均能不同程度地抑制SOD活性，并且与细胞内ROS水平密切相关。其中，多氧硝酸盐是硝基化修饰中的硝化剂，由超氧阴离子与一氧化氮反应生成；S-谷胱甘肽化修饰取决于细胞内ROS水平，由氧化和亚硝化应激诱导[27-28]。因此，推测本实验中1-MCP在贮藏前期通过刺激GbSOD相对表达量提高SOD的合成，而在贮藏后期通过降低ROS水平从而减少SOD硝基化和S-谷胱甘肽化修饰，从而保持高于对照组的SOD活性水平。

APX和CAT负责进一步清除SOD的产物H2O2。1-MCP分别在贮藏前期和后期提高了紫背天葵叶片的APX和CAT活力，这可能是由于两种酶是不同的H2O2清除酶类别，即APX可能负责精细调节ROS中间体的信号转导，而CAT可能负责清除过量的ROS[29]。另外1-MCP对两种酶活性的提高可能是因为刺激并上调了GbAPX和GbCAT的相对表达量。GR是AsA-GSH循环中重要的酶，负责将GSSG转化为GSH[30]。本研究发现1-MCP可能通过刺激GbGR的表达，提高GR活性，从而合成了更多的GSH，这有助于在各种非生物胁迫下保持GSH/GSSG的高比例。POD能够分解H2O2为H2O和O2。本研究表明，1-MCP处理能在第1天显著刺激GbPOD42相对表达量并提高POD活性，这可能是受到了ROS迸发的诱导。但同时POD也能将多酚类物质氧化为醌类物质[31]，醌类物质反向歧化为邻醌自由基，间接参与ROS的生成[32]。本研究表明，1-MCP处理后期降低了POD的活性，从而直接降低了酚类氧化的风险，同时间接地减少了ROS的积累。1-MCP对采后紫背天葵叶片抗氧化系统的影响如图9所示。

图9 1-MCP对采后紫背天葵叶片抗氧化系统影响的简要模型Fig.9 Simple model for the effect of 1-MCP on the antioxidant system in G.bicolor leaves

综上，本实验利用10 μL/L 1-MCP处理紫背天葵，结果发现1-MCP提高了紫背天葵的感官品质，抑制了呼吸强度，减少了超氧阴离子和H2O2的积累，保持了AsA和GSH含量，同时在不同的贮藏时间总体上不同程度地上调抗氧化酶相关基因（GbSOD、GbAPX1、GbCAT、GbGR）的相对表达量并提高了SOD、APX、CAT、GR的活力，从而提高了抗氧化能力，延缓了采后紫背天葵衰老进程。