大鼠颅骨骨缝间充质干细胞与骨髓间充质干细胞成骨及成脂能力比较研究

何畏，曹曦

电子科技大学医学院附属绵阳医院·绵阳市中心医院口腔科，四川 绵阳 621000

间充质干细胞是具有多向分化能力的干细胞，其应用于颅颌面骨缺损修复是近年来的研究热点。在目前的颅颌面骨组织工程研究及临床应用中，由于长骨骨髓间充质干细胞易于获取，纯度高，通常以股骨和胫骨来源的骨髓间充质干细胞为主[1-3]。近年来，研究者在颅颌面骨骨缝中发现新的间充质干细胞并成功分离培养，并证实颅颌面骨骨缝间充质干细胞(calvarial suture stem cells，CSSCs)是颅颌面骨主要的干细胞，引起成骨端、骨膜、硬脑膜及颅面骨的形成，主要参与颅颌面的形成发育及缺损修复[4-6]。当颅颌面骨骨缝间充质干细胞增殖、分化和凋亡程序出现紊乱时，即可引发颅颌面骨发育障碍[7-9]。骨髓间充质干细胞与颅颌面骨骨缝间充质干细胞胚层来源不同，四肢骨骼仅由中胚层来源，通过软骨内成骨形成；颅颌面骨为扁骨，来源于神经嵴和轴旁中胚层，通过软骨内成骨和膜内成骨形成[10]。本实验通过分离培养大鼠颅骨骨缝间充质干细胞和股骨骨髓间充质干细胞，并对其进行鉴定。随后在体外分别进行成骨诱导和成脂诱导，分析两种细胞的成骨和成脂能力差异。本实验旨在研究不同骨骼来源的间充质干细胞之间的差异，对颅颌面骨组织工程的发展和临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 出生5 d的SD(Sprague Dawley)大鼠10只由四川大学实验动物中心提供。

1.1.2 实验试剂和仪器α-MEM培养基(Hy-Clone公司，美国)；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(GIBICO公司，美国)；青霉素和链霉素(华北制药有限公司)；FITC-抗CD29、FITC-抗CD11b、FITC-抗CD45、FITC-抗CD90(BioLegend)；多聚甲醛(Sigma-Aldrich)；磷酸盐缓冲液；消毒酒精(口腔疾病研究国家重点实验室)；成骨诱导液的配置：含10%FBS的DMEM培养液，10 mmol/Lβ甘油磷酸钠0.05 mmol/L维生素C和100 mmol/L地塞米松；COL1A Antibody(COL-1)(生产商：Santa)；Anti-Alkaline Phosphatase(生产商：Abcam)；RUNX2(D1L7F)Rabbit mAb(生产商：CST)；Anti-Osteocalcin antibody[OC4-30](生产商：Abcam)；β-Actin(4D3)monoclonal antibody(生产商：Bioworlde)；钙盐染色液(茜素红S)、碱性磷酸酶染色液(生产商：Leagene)；M-PER蛋白提取剂(Thermo Fisher Scientific)；蛋白酶及磷酸酶抑制剂(Roche)；4×LDS样品缓冲液(Invitrogen)；BioMax胶片(Kodak)；成脂诱导培养液(Stem Cell Technologies Inc)；油红O(Sigma-Aldrich)；M-PER蛋白提取剂(Thermo Fisher Scientific)；抗PPARγ抗体、抗LPL抗体(Santa Cruz)；吸管若干、5 mL一次性注射器、25 cm2塑料培养瓶、15 mL塑料离心管、30 cm2塑料培养皿、六孔培养板(Corning)。其他：组织剪、眼科剪、眼科镊、纱球、无菌纱布、骨膜分离器。超净工作台(苏州市净化设备总厂)；Beckman低温低速离心机(Beckman公司，美国)；DMLS光学显微镜(LEICA公司，德国)；二氧化碳培养箱(SHELL/JB公司，美国)；HH-4数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；倒置相差显微镜(Olympus，日本)；流式细胞仪(Becton-Dickinson)；WD-9405B型水平摇床(北京市六一仪器厂)；电泳电源(CIB-RAD)，制胶器，转膜仪，电泳槽(北京市六一仪器厂)；PVDF膜(MILLIPORE)；FTC3000实时荧光定量基因扩增仪(FUNGLYN公司，加拿大)；相机。

1.2 实验方法

1.2.1 CSSCs的体外分离、培养 取出生后5 d SD大鼠，颈椎脱臼处死，浸入75%酒精中消毒，3 min后取出，无菌条件下沿颅骨正中缝切开皮肤及皮下组织，剔除附着的结缔组织及骨膜，保留正中缝两侧各1 mm，小心切下，并与硬脑膜分离。用PBS缓冲液反复冲洗分离好的骨缝区骨块。将骨缝区骨块剪成小段，置于含10%胎牛血清α-DMEM培养基内，接种于培养皿中，培养基量仅覆盖骨块即可。放置于37℃，5%CO2的培养箱中。每隔4~5 h观察培养基的量，适时添加。2~3 d后，细胞将从骨块中心的骨缝区爬出。以后每3 d全量换液一次。

1.2.2 BMSCs的体外分离、培养 取出生后5 d SD大鼠，颈椎脱臼处死，浸入75%酒精中消毒，3 min后取出，无菌条件下分离双下肢，将分离好的股骨和胫骨浸入预先置有PBS缓冲液培养皿中。PBS彻底冲洗骨表面，剪去双侧骨骺端，用无菌注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔2~3次，冲出骨髓，将冲出液收集到离心管中，吹打混匀后进行离心，1 500 r/min×5 min。弃去上清液，用含10%胎牛血清的α-DMEM培养基重悬，并充分吹均匀，用无菌滴管将细胞悬液接种于25 cm2塑料培养瓶中，置于37℃，5%CO2的培养箱中，24 h半量换液，以后每3 d全量换液一次。

1.2.3 CSSCs和BMSCs的体外扩增 待9~12 d，细胞达到80%~90%融合后吸弃培养基，以PBS冲洗2~3次，加入1~2 mL混合消化液(0.02%EDTA：0.25%胰酶=1∶1)，按1∶2传代培养。之后每3 d换液一次，密切观察细胞生长情况，待细胞基本融合，再以上述方法进行连续传代扩增培养至第三代用于以后试验。

1.2.4 CSSCs和BMSCs表型分析 将第三代CSSCs和BMSCs经消化、离心、重悬后，各分成两管，作为抗体指标和同型对照。分别加入CD-29、CD11b、CD90、CD45，以及其相应的同型对照。孵育15 min(切记要避光)后，加入PBS终止，1 200 r/min离心5 min，弃上清。PBS重悬，流式细胞仪检测。重复测定3次。

1.2.5 CSSCs和BMSCs体外成骨诱导 取第三代CSSCs和BMSCs，按照1×106/L的细胞密度进行接种，2 d贴壁后开始进行成骨诱导。除去培养液，加入成骨诱导液。细胞成骨诱导14 d后进行Ⅰ型胶原免疫荧光检测和碱性磷酸酶染色。诱导21 d后进行茜素红染色。

1.2.6 免疫印迹法(Western blot)检测细胞成骨分化蛋白表达水平差异 取第三代CSSCs和BMSCs，按照1×106/L的细胞密度接种于培养瓶内，2 d贴壁后开始进行成骨诱导。诱导1周后每瓶细胞加入含PMSF的裂解液400μL，收集细胞碎片和裂解液移至1.5 mL离心管中，4℃，12 000 r/min离心5 min。将上清转移到离心管中，加入loading-buffer煮沸5 min使蛋白变性，加样品于10%SDS-PAGE电泳分离蛋白样品，30 V恒压转膜2 h。配制封闭液，将脱脂牛奶5.0 g加入100 mL TBST，混匀。加入一抗匀速震摇，4℃过夜。TBST振洗15 min，重复4次。TBST振洗15 min，重复4次。将膜取出，置于曝光盒，加入发光底物避光孵育5 min，进入暗室，将胶片压在膜上进行曝光。在Typhoon系统上扫描结果，Image J软件分析灰度值，以β-actin为内参，实验重复三次。

1.2.7 聚合酶链式反应(PCR)检测细胞成骨分化基因表达 取第三代CSSCs和BMSCs，按照1×106/L的细胞密度接种于培养瓶内，2 d贴壁后进行成骨诱导。诱导1周后，每孔加1 mL TRIzol Reagent裂解细胞，反复吹打，将裂解液收集进1.5 mL离心管，每管加0.2 mL氯仿和0.5 mL异丙醇，混匀后室温孵育10 min，12 000 r/min，4℃离心10 min。移去上清液，用75%乙醇洗涤沉淀，7 400 r/min，4℃离心5 min。移去乙醇，自然晾干沉淀5~10 min。加入DEPC处理水，溶解RNA沉淀。检测RNA质量和RNA浓度。将mRNA反转录成cDNA，采用20 uL体系，置于PCR仪上，37℃反应15 min、85℃反应5 s、4℃反应5 min合成cDNA。采用20 uL体系对cDNA进行扩增，本步骤均在冰上操作。引物设计序列如下：ALPF：TTGGACTGACTGGGAAGGGAGA；ALPR：TCAATC CTGCCTCCTTCCACTA；OCNF：TCTCTCTGCTCAC TCTGCTGG；OCNR：CGAGGTTCAGGTAACAACTC CATC；RUNX2F：GGCCGGGAATGATGAGAACTA；RUNX2R：GTTTCACTTTGAGAACGGAGCAG。

1.2.8 CSSCs和BMSCs体外成脂诱导 取第三代CSSCs和BMSCs，按照1×106/L的细胞密度接种于6孔板，2 d贴壁后开始进行成脂诱导，3 d换液一次。成脂诱导2周后进行油红O染色。

1.2.9 Western Blotting检测细胞成脂分化蛋白表达水平 实验方法同上。

1.3 主要观察指标 ①CSSCs和BMSCs的特点，流式鉴定结果；②CSSCs和BMSCs成骨分化能力；③CSSCs和BMSCs成脂分化能力。

1.4 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件分析数据。计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间数据的比较采用One-way ANOVA分析，组内两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CSSCs的分离、培养和传代扩增特点 分离获取的骨缝碎块在培养3~4 d后可见细胞从骨缝区爬出(图1A)。待细胞慢慢分裂增殖后细胞表现出形态的多样性。约2周后贴壁细胞接近80%融合，贴满瓶底，形态多为梭形或星形(图1B)。此时进行传代，刚传代的细胞呈球形，生长潜伏期较原代细胞短，沉降贴壁速度较原代细胞快，待长满培养瓶底，此时即可再传代(图1C)。

图1 不同时期大鼠颅骨骨缝间充质干细胞形态(×40)

2.2 BMSCs的分离、培养和传代扩增特点 分离获取的BMSCs培养72 h后细胞开始进行分裂增殖，形成比较大片的细胞团(图2A)。约1周后细胞形成集落，多为成纤维细胞形态，互相融合成片(图2B)。9~12 d后贴壁细胞接近80%~90%融合，贴满瓶底，形态多为梭形。此时进行传代，传代后的细胞形态与原代一致，增殖速度与原代相比明显增快。多次传代后，BMSCs细胞纯度更高，呈现更均匀的成纤维细胞样分布特征(图2C)。连续传代，形态无明显变化。

图2 不同时期大鼠骨髓间充质干细胞形态(×40)

2.3 CSSCs的鉴定 第三代CSSCs流式检测结果显示：高表达CD90、CD29且阳性率分别为99.8%和99.9%，CD11b及CD45基本呈阴性(图3)。说明培养扩增的细胞具有干细胞特征，为MSCs中的一群。

图3 CSSCs表面抗原检测

2.4 BMMSCs的鉴定 P3代BMSCs流式检测结果显示：高表达CD90、CD29且阳性率分别为99.6%和99.4%，CD11b及CD45基本呈阴性(图4)。说明培养扩增的细胞具有干细胞特征，为MSCs中的一群。

图4 BMMSCs表面抗原检测

2.5 CSSCs和BMSCs成骨诱导分化能力比较成骨诱导14 d后，CSSCs和BMSCsⅠ型胶原免疫荧光染色均呈阳性反应，且CSSCsI型胶原的表达高于BMMSCs(图5A、5B)。碱性磷酸酶(ALP)染色结果显示大部分CSSCs和BMSCs胞质中可见红色ALP阳性颗粒，CSSCsALP染色阳性区域多于BMMSCs(图5C、5D)。成骨诱导21 d后，茜素红染色结果显示CSSCs和BMSCs成骨诱导后均出现茜素红阳性区域，CSSCs阳性区域更多(图5E、5F)。因此，CSSCs和BMSCs均可向成骨细胞分化，CSSCs体外成骨分化能力较BMMSCs强。

图5 CSSCs和BMSCs成骨诱导分化能力

2.6 细胞成骨分化相关蛋白表达水平比较 在成骨诱导7 d时对ALP、OCN、RUNX2蛋白水平进行检测，采用Image J对Western blot条带进行量化。结果显示CSSCs组ALP、OCN、RUNX2蛋白含量高于BMSCs组，以β-actin为内参，RUNX2、ALP、OCN蛋白含量在CSSCs中的表达分别是BMSCs的2.1、1.8、1.5倍，差异有统计学意义(P<0.05)，见图6。

图6 Western blot检测成骨分化相关基因的表达水平

2.7 细胞成骨分化相关基因表达水平比较 成骨诱导7 d对ALP、OCN、RUNX2 mRNA水平进行检测，结果与蛋白差异基本一致，CSSCs组ALP、OCN、RUNX2mRNA相对表达量高于BMSCs组，以GAPDH为内参，RUNX2、ALP、OCNmRNA水平在CSSCs中的表达分别是BMSCs的2.23、1.92、1.56倍，差异有统计学意义(P<0.05)，见图7。

图7 RT-PCR检测细胞成骨分化相关基因表达水平

2.8 CSSCs与BMMSCs体外成脂诱导

2.8.1 油红O染色 成脂诱导14 d进行油红O染色。染色结果显示CSSCs与BMMSCs体外成脂诱导后均出现染色阳性区域，BMSCs油红O阳性区域更多。因此，油红O染色说明CSSCs较BMMSCs体外成脂分化能力弱，见图8。

图8 油红O染色(×40)

2.8.2 细胞成脂分化相关基因PPARγ和LPL表达水平比较 成脂诱导7 d对PPARγ和LPL蛋白水平进行检测，采用Image J对Western blot条带进行量化。结果显示CSSCs组PPARγ和LPL蛋白水平含量低于BMSCs组，以β-actin为内参，PPARγ和LPL蛋白水平在BMSCs中的表达分别是CSSCs的2.5、1.8倍，差异有统计学意义(P<0.05)，见图9。

图9 Western blot检测成脂分化相关基因表达水平

3 讨论

除了生命中的自然更替，骨骼还具有自我修复能力，以应对损伤或疾病导致的骨质流失[11]。大量骨缺损模型研究已证实，间充质干细胞在损伤和疾病造成的骨质流失修复中起了巨大作用[11-13]。长骨骨髓间充质干细胞的来源已被广泛研究多年，研究发现其中主要的干细胞群体驻留在骨髓腔血管周围[3，14]。目前BMSCs的体外分离培养方法已经很成熟，做到无菌操作即可。根据BMSCs在塑料组织培养瓶中贴壁生长的特性，骨髓贴壁法已成为一种简单易行、操作性较强的分离培养方法[15]。所得BMMSCs活力好，贴壁生长以及扩增传代较理想[14]。相比之下，目前对干细胞在颅骨修复中的作用知之甚少。与长骨不同，颅面骨为扁骨，主要由膜内成骨形成，而不是软骨内成骨，因此骨髓腔空间极小。先前的研究认为，上覆的骨膜和下覆的硬膜为颅骨骨修复提供骨祖细胞[16-18]，最近的研究发现颅骨骨缝间充质中存在具有多种分化能力和内在修复潜力的干细胞群[19-20]。骨缝区骨髓量极少，无法采取常规方法获取颅骨骨缝区骨髓，因此只能采用骨缝区骨块进行培养，将骨缝区骨块分离，尽量去除骨缝区周围骨，但不破坏骨缝，待细胞自行爬出，并进行相应的鉴定。本实验分别从大鼠的股骨骨髓和颅骨骨缝中分离培养干细胞，BMSCs约1周后形成集落，多为成纤维细胞形态，互相融合成片。9~12 d后贴壁细胞接近80%~90%融合，贴满瓶底，形态多为梭形。分离获取的颅骨骨缝碎块在培养3~4 d后可见细胞从骨缝区爬出。约2周后贴壁细胞接近80%融合，贴满瓶底，形态多为梭形或星形。经过细胞表面标志鉴定，BMSCs与CSSCs均高表达CD90、CD29(表示细胞处于原始的未分化状态)，而细胞表面抗原CD11b、CD45(两者均属造血系统细胞标记物)几乎不表达CD90[21]。根据检测结果，可初步确定其即为本研究需要的BMSCs和CSSCs。

分化潜能是间充质干细胞应用于组织工程的基本前提。该研究分离的骨髓间充质干细胞和颅骨骨缝间充质干细胞经体外成骨、成脂诱导后，均可合成I型胶原，形成钙结节、碱性磷酸酶颗粒和脂滴，同时对ALP、OCN、RUNX2三个骨形成相关因子以及PPARγ和LPL两个脂形成相关因子的蛋白和mRNA分别进行western blot和PCR检测。研究发现颅骨骨缝间充质干细胞与骨髓间充质干细胞具有相同的生物学特性：均可以体外多向诱导分化；且颅骨骨缝间充质干细胞的成骨分化能力更强，而骨髓间充质干细胞的成脂分化能力更强，因此颅骨骨缝间充质干细胞更适用于骨组织工程。近来有研究成功分离培养下颌骨间充质干细胞，并发现下颌骨间充质干细胞较骨髓间充质干细胞的成骨向分化能力更强，而成脂分化能力弱[22]，与颅骨骨缝间充质干细胞的多向分化能力相似。目前研究认为出现此差异是由于骨髓间充质干细胞与颅颌面骨间充质干细胞胚层来源不同，四肢骨骼仅由中胚层来源，通过软骨内成骨形成；颅颌面骨为扁骨，来源于神经嵴和轴旁中胚层，通过软骨内成骨和膜内成骨形成[10]，因此颅骨骨缝间充质干细胞与下颌骨间充质干细胞具有类似的多分化能力，而与骨髓间充质干细胞之间存在一定差异。

干细胞分化能力对于适当的自我修复至关重要，以此来应对损伤或生理性的骨丢失。目前存在大量关于干细胞自我修复机制的研究。研究发现骨髓间充质干细胞通过建立一个可再生的造血微环境来帮助修复，同时也为所有新形成的骨骼成分提供祖细胞[23-24]。关于颅骨骨缝间充质干细胞的招募机制和颅骨创面修复过程中的作用，已有研究证实与之前认为参与颅骨修复的祖细胞主要位于骨膜的观点相反，具有再生能力的是组织间质内的干细胞，而不是周围的膜[20，25]。当颅骨骨缝间充质干细胞直接移植到损伤部位后可以改善损伤修复，强烈提示对骨修复有直接作用[6]。由此可见，颅骨骨缝间充质干细胞的成骨分化能力在组织再生中发挥了巨大的作用。

综上，本研究成功分离培养出骨髓间充质干细胞和颅骨骨缝间充质干细胞，并进行成骨、成脂诱导，发现颅骨骨缝间充质干细胞成骨能力更强，而骨髓间充质干细胞成脂能力更强，为其在颅颌面骨组织工程的发展和临床应用中提供实验依据。