柱花草低落粒种质筛选及农艺性状综合评价

张靖雪， 盛 伟， 李欣勇， 罗丽娟*

(1.海南大学热带作物学院， 海南 海口 570228；2.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所， 海南 儋州 571737)

落粒性是植物在长期的演化过程中，为繁衍后代，抵御外界恶劣环境所形成的一种适应性机制，这一现象在豆科和禾本科植物中广泛存在[1-2]。在生产实践中，由于牧草种子成熟时在母体上的持留性较差，会脱离母体而掉落，这一特性使种子产量损失严重，不利于品种的推广种植同时也增加了种子采收难度。研究显示，由于种子成熟的不一致性和差异性，种子实际产量为潜在产量的10%～20%[3]。落粒性的丧失是作物驯化过程中的关键一步[4]，低落粒种质的筛选应作为牧草选育尤其是落粒严重品种育种的重要目标之一。

柱花草(Stylosanthesguianensis)原产于美洲，具有茎叶产量高、品质好、抗旱能力强、耐贫瘠、适口性好等特点，主要用于天然草地改良、绿肥覆盖、水土保持及饲料作物等[5-8]。目前，柱花草已经在我国的广东、广西、海南、云南、四川攀枝花等干热河谷地区推广种植[9-12]，已成为我国南方热带草业的当家草种，初步形成了“北有苜蓿草(Medicagosativa),南有柱花草”的草业发展新格局[13-14]。然而柱花草种子普遍存在落粒率高，种子成熟后若不及时收获，落粒率可达60% 以上，这给后期管理、打草收种、机械操作带来诸多困难，造成种子产量和质量的下降。长期以来，柱花草的育种目标都集中在产量[15-16]、品质[17]、抗性[18]等方面，对于柱花草种子落粒性的研究未见报道。中国热带农业科学院现保存有26个种共498份柱花草种质[19-20]，丰富的柱花草资源为种质创新、新品种选育提供了重要的物质基础。本研究选取来自不同地区的68份柱花草种质为材料，对花后不同时期的农艺性状及落粒率进行田间观测，并对其进行综合评价，从而加速柱花草抗落粒品种的选育和推广。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所牧草研究室试验基地(19°30′N，109°30′E)，海拔149 m，属热带季风气候，年降水量1 437.0～3 022.7 mm，其中雨季(5—10月份)降水量最为丰富，全年无霜，年均温度为24.7℃,土壤为花岗岩发育的砖红土壤[21]。

1.2 试验材料

试验所用的68份柱花草种质均由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供(表1)。2019年2月份将试验材料放置于光照培养箱发芽，幼苗长出3片叶时移栽到田间试验地，进行常规田间管理。

表1 供试68份柱花草种质Table 1 68 Stylosanthes germplasms used in this study

1.3 试验设计及指标测定

试验采用完全随机区组设计，每份种质种植3个小区，每小区面积3 m2(1 m×3 m)，株距为0.5 m，行距为0.5 m，重复3次。2020年在柱花草种子成熟时，每个小区取10株单株，测其叶柄长、小叶长、小叶宽、茎粗、株高、主枝条数、侧枝条数、千粒重和落粒率共9项农艺性状。叶柄长为叶片基部与主茎连接处之间的距离；小叶长为叶片基部至叶片尖端的距离；小叶宽为叶片最大直径；茎粗即为植株主茎距地面5 cm处的最大直径；株高即地面至植株顶端的距离，以上性状均需使用游标卡尺测定。主枝条数为植株中心主干上分生出的大枝条数，侧枝条数则为主枝条上分生出的小枝数。各性状测定时每株随机选取5个分枝进行测量，测量后取平均值。千粒重测定采用百粒法，即纯净种子中随机取100粒种子，重复8次，由此计算千粒种子重量。落粒率的测定采用套袋法，待68份柱花草种质授粉后，每份种质随机选取5个单株，每个单株随机选取5个生殖枝进行套袋，从授粉后开始每隔7 d测定一次掉落袋中的种子数，直至完熟期。测定结束后，总落粒数与测定花序上剩余粒数之和为所测花序子粒总数，总落粒数与总子粒数的百分比值即为落粒率。落粒率计算公式如下：

落粒率(%)=(种子落粒数/花序子粒总数)×100

1.4 数据处理

对观测得到的各平均值采用Excel 2007进行数据初步整理，然后使用SPSS 20.0分析软件对各观测数据进行主成分、相关性和聚类分析，从而更直观的展现柱花草的落粒动态及其农艺性状。根据特征值大于1的标准，对柱花草进行主成分分析，柱花草农艺性状的大部分信息可以由主成分概括[22]。最后利用隶属函数法进行农艺性状综合评价，各指标隶属函数值大小可以反映各性状品质优劣，根据各指标隶属函数平均值大小对供试材料的性状优劣进行综合评价，为筛选柱花草优质育种材料提供科学依据。

2 结果与分析

2.1 柱花草重要农艺性状变异分析

由图1可知，68份种质落粒率变化范围为27%～99%，落粒率在50%以下的种质仅有7份。由表2可知，9个农艺性状中，主枝条数的变异系数最高，为67.2%，其次为茎粗和株高，分别为48.6%，40.1%，说明柱花草的主枝条数、茎粗、株高存在较大的遗传变异。叶柄长、小叶长、小叶宽、侧枝条数、千粒重和落粒率的变异系数均达到20.0%以上，表明这几种农艺性状也存在较为丰富的遗传变异，同时也说明落粒现象在柱花草各种质间普遍存在。

图1 68份供试柱花草种质落粒率Fig.1 The average seed shattering rate of 68 Stylosanthes

表2 柱花草9个农艺性状的变异分析Table 2 The variation analysis of 9 morphological traits of Stylosanthes

2.2 柱花草重要农艺性状的相关性分析

对柱花草9个农艺性状的相关性分析结果表明(表3)，小叶长与叶柄长呈极显著正相关，相关性系数为0.550；小叶宽与叶柄长、小叶长呈极显著正相关，相关性系数分别为0.539，0.516；株高与叶柄长、小叶长、小叶宽呈极显著正相关，相关性系数分别为0.424，0.519，0.422；茎粗与小叶长呈极显著负相关，相关性系数为-0.337；千粒重与茎粗呈显著正相关，相关性系数为0.255；千粒重与落粒率呈显著负相关，相关性系数为-0.260；落粒率与小叶长呈极显著正相关，相关性系数为0.401；落粒率与茎粗呈极显著负相关，相关性系数为-0.654，这表明柱花草低落粒种质通常表现为茎粗较粗，小叶较短的特征，并且具有较大的千粒重，因此，可以为低落粒柱花草种质的田间筛选提供参考。

表3 柱花草农艺性状相关性分析Table 3 Correlation analysis on the agronomic traits of Stylosanthes

2.3 柱花草农艺性状的聚类分析

对供试柱花草9个农艺性状进行聚类分析(图2)，结果表明68份材料被聚为5大类群。第Ⅰ类包括44份材料，这类材料主枝条数较少，株高较高，叶柄和小叶较长，茎粗表现为中间水平。第Ⅱ类材料包含4份材料，这类材料株高较高，主枝条数少，叶部性状表现中间水平。第Ⅲ类包含9份材料，这类材料各类性状总体表现为中间水平。第Ⅳ类包括8份材料，这类材料主要表现为株高较矮，茎粗较小，叶片较小，落粒率较高。第Ⅴ类包含3份材料，这类材料株高最矮，主枝条数最多，小叶较长且落粒率很高。

图2 基于柱花草9个农艺性状的聚类图Fig.2 The cluster of Stylosanthes based on 9 agronomic traits

以落粒率为变量对柱花草种质进行聚类分析(图3)，68份种质被分为2大类，4亚类。第Ⅰ亚类包含39份材料，这些材料的落粒率在85%～99%之间，落粒率最高；第Ⅱ亚类包括17份材料，落粒率在65%～85%之间；第Ⅲ亚类包括TF0027，TF0074，TF0110三份材料，落粒率在27%～37%之间，这类材料落粒率最低；第Ⅳ亚类包含9份材料，落粒率均在43%～57%之间。

图3 以柱花草落粒率为变量的聚类图Fig.3 The cluster of Stylosanthes based on seed shattering rate

2.4 柱花草9个农艺性状的主成分分析

对供试柱花草的9个农艺性状进行主成分分析(表4、表5)，结果表明，影响柱花草农艺性状的前3个主成分的累加贡献率达65.178%，特征值总和为5.866，表明这3个主成分完全可以表现出柱花草9项指标所代表的大部分信息。第1主成分的特征值是2.619，贡献率为29.101%。第1主成分主要受小叶长(0.889)的影响，其次是叶柄长(0.733)、小叶宽(0.710)，说明第1主成分主要反映柱花草的叶片性状特征。第2主成分的特征值是1.937，贡献率为21.521%，第2主成分主要受茎粗(0.750)的影响，表明第2主成分主要反映柱花草茎部特征。第3主成分的特征值是1.310，贡献率为14.556%，第3主成分受主枝条数(0.805)的影响最大，侧枝条数(负值)次之，说明第3主成分主要反映柱花草茎部分蘖特征。

表4 供试材料9个农艺性状的主成分分析Table 4 Principal component analysis at 9 agronomic traits of Stylosanthes

表5 关于9个性状的前3个主成分对应的特征向量Table 5 Eigen vector of the first three Principal Component of 9 agronomic traits

2.5 柱花草农艺性状综合评价

对柱花草的9个农艺性状求其隶属函数值(表6)，隶属函数值的大小能够反映种质性状的优劣，隶属函数值越接近于1，则说明该性状表现越优异；反之，隶属函数值越接近于0，则该性状表现越差。然后求各材料性状隶属函数值的平均值，平均值大小越接近1的，则表示该材料综合性状表现越优异；平均值越接近0的，那么该材料综合性状的表现越差。通过计算柱花草9个农艺性状的隶属函数值可知，供试柱花草种质的隶属函数均值在0.234～0.627之间，其中均值大于等于0.550的有TF0115，TF0177，TF0207，TF0275四份材料，主要表现为叶柄长和小叶宽大，植株高大。其次为TF0041，TF0042，TF0209，TF0228，TF0244，TF260，TF0285和TF0321综合性状表现较好，隶属函数平均值分别为0.541，0.547，0.549，0.539，0.527，0.535，0.506和0.504；隶属函数值小于0.255的有3份。分别为TF0035，TF0074和TF0191，主要表现为叶柄短，小叶较小，植株矮小。

表6 供试68份柱花草各农艺性状隶属函数分析Table 6 The subordinate function analysis of agronomic traits of 68 Stylosanthes

续表6

3 讨论

3.1 柱花草落粒性

柱花草是热带地区的重要豆科牧草，种子成熟期一般为12月至翌年1月，但柱花草种子成熟期不一致并且边成熟边脱落，给种子生产和收获造成了严重影响[23]。本研究对68份柱花草材料田间落粒率测定，结果表明柱花草种子落粒性强这一特性普遍存在于柱花草各种质间，落粒率高于50%的种质占供试种质总数的85%以上，种质TF0255落粒率最高；TF0027，TF0074及TF0110三份材料的落粒率较低，表明其抗落粒性较强。对68份供试柱花草落粒率进行聚类分析后发现，第Ⅲ亚类材料表现出低的落粒率。低落粒的种质是研究抗落粒柱花草新品种的基础，落粒性不同的种质可以为今后开展柱花草遗传变异和分子机制的研究提供重要的试验材料。同时，也可以选用低落粒品种作为亲本，选配杂交组合材料来改良现有的品种。

3.2 柱花草农艺性状相关性

各农艺性状所代表的信息有一定程度的重复性，单个性状指标的作用不完全相同，因此，主成分分析通过降维的方式将各指标之间复杂的相关关系转换成少数的几个相互独立的主成分进行分析，每个主成分都能最大限度地反映原始变量的信息[24-26]，并进行科学合理的评价。主成分分析中提取出的3个主成分因子客观的反映了柱花草资源的特征。对9个农艺性状进行变异分析发现，主枝条数变异系数最大，表明其多样性最丰富，其次为茎粗和株高多样性较丰富。各农艺性状相关性分析表明，柱花草落粒率与小叶长呈极显著正相关，与茎粗呈极显著负相关，与千粒重呈显著负相关，这表明农艺性状表现为小叶较短，茎粗较大的种质，其落粒率较低，千粒重也较大，从而种子产量也会相应增加。这与前人[27]的研究结果相似。通过对68份材料的9个农艺性状进行聚类分析，种质被分为3大类，5个亚类，发现性状表现相似的大部分被聚为同一类群，但其中也有少部分性状表现差异较大的也被分在同一类群，这可能是因田间试验过程中气候环境条件以及人为因素的影响而使农艺性状聚类分析的结果不稳定[28-29]。聚类分析是根据遗传距离来进行分类，而遗传距离的计算又是根据各性状的表现型，表现型又受到基因型和环境的共同影响[30-31]。因此，合理的设计试验，严格统一的环境控制及田间操作管理可以保证聚类分析结果的准确性，也可以通过农艺性状分析与分子标记方法分类结果相结合，从而能够更有效地对柱花草种质资源进行科学全面的筛选评价[32]。

4 结论

本研究明确了柱花草种子落粒性、主要农艺性状的遗传多样性及各农艺性状之间的相关性，筛选出了TF0115，TF0177，TF0207，TF0275综合性状表现优良的柱花草种质。本研究结果为柱花草低落粒种质的筛选、遗传改良以及品种选育提供了重要的参考。