舟叶橐吾浸提液对三种牧草种子萌发及幼苗生长的影响

王 辉， 马向丽， 另如贵， 张 燕， 任 健， 代微然

(1.云南农业大学动物科学技术学院， 云南 昆明 650201； 2.云南农业大学科学技术处， 云南 昆明 650201)

香格里拉位于青藏高原东缘，地处云南西北部，草地资源丰富，是云南的主要牧区，拥有可利用草地面积24.9万hm2，当地农牧民以饲养牦牛、犏牛、高原黄牛等草食家畜为主，草地畜牧业是当地农牧民的重要家庭经济来源。在香格里拉，高山草甸主要分布在海拔 3 200～3 900 m，作为冬春季牧场和过渡性牧场放牧利用[1]。长期以来，受人为和自然因素影响，香格里拉亚高山草甸优良可食牧草锐减，狼毒(StellerachamaejasmeLinn.)、西南鸢尾(IrisbulleyanaDykes.)、舟叶橐吾(Ligulariacymbulifera(W. W. Smith) Hand.-Mazz.)等恶性杂草大量滋生，使得草原可食牧草产量严重下降，草地退化严重。如何减轻草地退化是当地农户和广大畜牧工作人员面临的问题。

化感作用是指一个活体植物通过向环境释放自身产生的某种化学物质来影响周围植物的种子萌发和生长发育[2-3]，有利于近缘种或单一种的生长。化感作用能提高自身竞争能力，对种子萌发和幼苗生长的作用效果是不可逆的[4]。化感物质几乎存在于所有植物及其组织中，如叶、茎、根、花、种子、树皮和芽[5]。学者们针对牧草的化感作用进行了许多研究。牛欢欢等[6]研究发现光叶紫花苕(ViciaSativaL.)浸提液对白三叶(TrifoliumrepensL.)的化感作用强于多年生黑麦草(LoliumperenneL.)，且浓度增加抑制作用增强；而白三叶高浓度浸提液对多年生黑麦草和鸭茅(DactylisglomerataL.)生长同样具有显著的抑制作用，低浓度则表现为无影响或促进作用[7-8]。有研究进一步发现豆科牧草对多花黑麦草(L.multiflorumLam.)的化感作用存在显著的种间差异，且豆科牧草的化感物质使得多花黑麦草幼苗生长发育受到抑制[9]。自然界中存在的化感物质主要来源于植物产生的次生代谢物质[10]，有酚类、萜类、糖和糖苷类、生物碱和非蛋白氨基酸等[11]。植物化感作用通常是几个或几类次生代谢产物综合作用的结果[12]，往往是一种植物抑制或刺激其它植物种子的萌发、幼苗的生长发育[5,13]。化感作用的物质一般通过雨水冲刷、淋溶、挥发、根分解等方式进入到地表或者土层中，进而对周围植物产生一定的影响[14]。

舟叶橐吾，又名船型橐吾，是菊科(Compositae)橐吾属(Ligularia)的一种多年生草本植物，根肉质多数，茎直立，舌状花黄色，管状花深黄色[15]。在香格里拉退化草地上，往往舟叶橐吾是单一优势植物，其它植物稀少，有研究认为这是因为化感作用有利于自身或亲缘关系近的植物共存[4]。目前有关舟叶橐吾的研究主要集中在对化学成分及生物活性的研究，而关于舟叶橐吾对牧草的化感作用研究较少。在滇西北利用重度退化草地建设人工草地时，不可避免地会遇到受到橐吾泛滥的问题，为此本研究以当地广为利用的白三叶、多年生黑麦草及鸭茅作为受体牧草，探讨舟叶橐吾不同浓度地上部和根部浸提液处理对豆科和禾本科牧草种子萌发、幼苗生长的影响，了解舟叶橐吾的化感效应，为牧草种植、退化亚高山草甸改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2019年8月末从云南省迪庆藏族自治州格咱属都湖尼嘎牧场(27°57′50″ N，99°56′04″ E)样地上随机采集长势基本一致的舟叶橐吾，植株处于生长旺盛期，尚未开花。样地海拔3 658 m，属低纬度高海拔地区，气候类型属寒温带山地季风气候，秋冬长而春夏短，年平均气温5.4℃，最热月份(7月)月均气温13.2℃，最冷月(1月)月均气温-3.8℃。由于长年过度放牧，舟叶橐吾在样地上大量生长，并成为优势种，这在滇西北亚高山草甸具有一定的代表性。该地区土壤pH值5.8，有机质碳含量3.25%，有机质含量5.73%，碱解性氮含量13.2 mg·kg-1，速效磷含量27.2 mg·kg-1，速效钾含量265.9 mg·kg-1。

供试的白三叶(品种：‘海发’)、多年生黑麦草(品种：‘麦迪’)、鸭茅(品种：‘德娜塔’)种子由北京正道公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1不同部位舟叶橐吾水浸提液的制备 实验室内将植株分为地上部分(包括茎、叶)和根，在102℃杀青半小时后，在60℃烘箱中烘干至恒重，打粉机粉碎制样，分别称取100 g，加入1 000 mL超纯水浸泡48 h，经双层纱布过滤后，滤液4 000 r·min-1离心5 min，取上清液作为母液(浓度为100 g·L-1)。分别量取地上部和根部母液25，50，75 mL于100 mL容量瓶中，定容，配制成相当于原舟叶橐吾质量浓度为0.025，0.050和0.075 g·mL-1的地上部浸提液和根部浸提液[16](此浓度梯度的设置基于预试验)，置于4℃的冰箱备用。

1.2.2种子萌发 在人工气候箱中利用培养皿滤纸法进行种子萌发试验，人工气候箱白天温度为(25±1)℃，夜晚温度为(20±1)℃，每天光照12 h，黑暗12 h，光强为4 000 lx，湿度为70%。在铺有两层滤纸培养皿(直径9 cm)中均匀放入50粒饱满的牧草种子，每两天分别加入0.025(低浓度)、0.05(中浓度)和0.075(高浓度)g·mL-1的水浸液6 mL，CK组加入等量蒸馏水，每个处理设置3个重复。每天统计各处理组发芽种子数，培养25 d后，每天记录种子发芽数，发芽试验以种子连续3 d不再萌发的时间为末次计数时间[16]。

1.3 测定指标

苗高、根长：在幼苗培养20 d后用直尺测量幼苗苗高、根长，随机抽取10株。

发芽势(Germination potential，GP)=规定天数内发芽种子数/供试种子数×100%(白三叶为发芽第4天的发芽种子数；多年生黑麦草为发芽第5天的发芽种子数；鸭茅为发芽第7天的发芽种子数)[8,17-18]。

发芽率(Germination rate，GR) = (发芽种子数/供试种子总数)×100%。

发芽指数(Germination index，GI)=∑(Gt/Dt)，Gt为第t日内的发芽数,Dt是相应的发芽天数。

化感效应指数(Allelopathic response index，RI)=1-C/T(T≥C)或RI=T/C-1(T 0时，表示促进作用；当RI< 0时，表示抑制作用；RI绝对值的大小代表化感作用强度[19]。

综合化感效应指数(Synthetic effects of allelopathic index，SE)反映化感效应的强弱，是指同一处理下对同一受体各测定项目化感效应指数(RI)的算术平均数。

1.4 叶片成分的非靶向测定

取舟叶橐吾新鲜叶片0.1 g置于5 mL EP管中，加入1 000 μL预冷提取液(甲醇氯仿体积比=3∶1)，再加入1 000 μL乙酸乙酯，加入5 μL核糖醇，涡旋30 s；加入钢珠后，35 Hz研磨仪处理4 min，将样本4℃离心，10 000 r·min-1离心15 min，进行代谢物的提取。随后，提取物通过一系列处理后，注入Agilent DB-5MS毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm,J&W Scientific，Folsom，CA，USA)，在Agilent 7890气相色谱-飞行时间质谱联用仪(GC-TOF-MS)进行检测(表1)。使用ChromaTOF软件(V 4.3x，LECO)对质谱数据进行了峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等分析。

表1 GC-TOF-MS具体分析条件Table 1 Specific analysis conditions of GC-TOF-MS

1.5 数据分析

利用SPSS 25.0统计软件对发芽率、发芽势、发芽指数、苗高、根长进行两因素的方差分析，探讨舟叶橐吾植株不同提取液对三种牧草种子萌发和幼苗生长的影响。在同一种牧草中，则采用Duncan检验法进行处理间的多重比较。并利用软件Sigmaplot 14.0作图。

2 结果与分析

2.1 舟叶橐吾浸提液对种子萌发的影响

舟叶橐吾不同部位、不同浓度的浸提液对3种牧草种子发芽率、发芽势和发芽指数影响均产生了显著的影响，而且牧草之间的差异显著(P<0.05)(表2)。与对照相比，供试牧草种子的发芽率、发芽势和发芽指数均显著下降(P<0.05)，其中高浓度的地上部分和根部浸提液使白三叶种子发芽率分别降低了76.03%和85.6%，多年生黑麦草的发芽率则分别降低了59.5%和77.7%，鸭茅的发芽率分别降低了69.4%%和90.7%(表2)。

无论是地上部还是根部浸提液处理，白三叶的发芽率、发芽势和发芽指数以及多年生黑麦草的发芽率和发芽指数均随着提取液浓度的增加而进一步降低，且不同浓度间均差异显著(P<0.05)。

化感效应指数表明，不同部位不同浓度的舟叶橐吾浸提液对供试种子的萌发有一定的抑制作用，且这种抑制作用与浸提液的浓度成正相关(表2)。发芽指数受到的抑制作用明显比发芽率强。相同浓度下根部浸提液较地上部浸提液对3种受体种子萌发的抑制作用更强(表2)。就发芽率、发芽势、发芽指数而言，两因素方差分析表明草种之间和不同舟叶橐吾浸提液之间存在显著的交互作用(表3)。

表2 舟叶橐吾水浸提液对3种牧草种子萌发的影响Table 2 Effects of aqueous extracts of Ligularia cymbulifera on seed germination of three forages

表3 牧草种类和浸提液浓度对3种牧草种子萌发的影响的交互作用Table 3 Interaction of species and extract concentration on Seed Germination of three forages

2.2 舟叶橐吾浸提液对幼苗生长的影响

舟叶橐吾同浓度根部浸提液对3种牧草幼苗生长的抑制作用大于地上部浸提液(P<0.05)。中高浓度的提取液对苗高和根的生长有一定的抑制作用，不过相比而言，苗高受到的影响要小一些(图1)，尤其是低浓度的提取液对苗高的生长影响不显著。相反，地上部及根部的中高浓度提取液均显著抑制幼苗高度的增加(P<0.05)。

与对照相比，白三叶和鸭茅的根长在不同处理下均受到了显著的抑制作用(P<0.05)。地上部低浓度浸提液对多年生黑麦根长的影响不显著，但是其他浓度抑制效果显著(P<0.05)。例如，高浓度的根浸提液使白三叶、多年生黑麦草及鸭茅根长分别降低了89.7%，66.4%，86.3%，可见抑制效应与草种有关(图1)。

图1 舟叶橐吾对3种牧草幼苗高度和根长的影响Fig.1 Effects of Ligularia cymbulifera extracts on the seedling height and root length of three forages注：不同小写字母表示在同一种牧草中不同处理间差异显著(P<0.05)。图例“地低”表示“地上部低浓度浸提液处理”；“地中”表示“地上部中浓度浸提液处理”；“地高”表示“地上部高浓度浸提液处理”；“根低”表示“根部低浓度浸提液处理”；“根中”表示“根部中浓度浸提液处理”；“根高”表示“根部高浓度浸提液处理”。下图同Note:Different lowercase letters within a species indicate there are significant differences among treatments at the 0.05 level,the same as below. The legend DD stands for low concentration extract from above-ground，DZ stands for medium concentration extract from above-ground,DG stands for high concentration extract from above-ground,GD stands for low concentration extract from root,GZ stands for medium concentration extract from root,and GG stands for high concentration extract from root. The same as below

2.3 舟叶橐吾浸提液对3种牧草的综合化感效应

从苗高和根长的化感效应指数(RI)来看，除了低浓度的舟叶橐吾地上部提取液影响不明显外，其它处理的RI值均为负值，说明舟叶橐吾的高中浓度地上部浸提液及三种浓度的根部浸提液显著抑制了供试牧草地上部和根的生长(图2)。

图2 舟叶橐吾对3种牧草种子苗高和根长影响的化感效应指数Fig.2 RI of Ligularia cymbulifera on the seedling height and root length of three forages说明：“CK”数值为0，因此无数据显示。下图同Note:“CK” value is 0,so no data is displayed. The figure below is the same

从种子发芽率、苗高及根长等方面的综合化感效应指数(SE)来看(图3)，白三叶、多年生黑麦草和鸭茅的SE值为负值，说明舟叶橐吾浸提液对3种牧草的生长都产生了不同程度的抑制作用。根据SE值的大小判断，敏感性最强的为鸭茅，白三叶和多年生黑麦草次之。

图3 舟叶橐吾对3种牧草的综合化感效应Fig.3 Synthetic allelopathic effects of Ligularia cymbulifera on three forages

2.4 舟叶橐吾叶片化学成分

GC-TOF-MS联用仪扫描到了812个色谱峰，随后根据质谱匹配、保留时间指数及峰面积等匹配，从KEGG数据库、PubChem数据库中定性出了283种代谢物。部分代谢物如表4所示，其中氨基化合物有3-羟基-L-脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、苯乙酰胺、谷氨酰胺等；有机酸类化合物有4-羟基苯甲酸、4-羟基肉桂酸、苯甲酸、抗坏血酸、咖啡酸、孜然酸、半乳糖醛酸等；酮类化合物有丙酮、薄荷酮1、3-羟基黄酮等；醇类化合物有乙醇胺、山梨醇等。

表4 舟叶橐吾叶片部分代谢物Table 4 Qualitative analysis of metabolites indentified in leaves of Ligularia cymbulifera

3 讨论

种子萌发是植物生命史中的关键环节，萌发后幼苗易受到外界环境变化的影响。牧草通过化感作用能抑制其它植物种子的萌发，尤其高浓度的提取物会抑制种子发芽和幼苗生长[20]。本试验中高浓度的地上部和根浸提液使白三叶种子发芽率分别降低了76.03%和85.6%，多年生黑麦草降低了59.5%和77.7%，鸭茅降低了69.4%%和90.7%。这与马瑞君[16]、兰措卓玛[21]和李晶[22]等的结果类似。3种牧草发芽指数、发芽率均降低，说明舟叶橐吾水浸提液的化感作用在影响发芽率的同时，也影响了种子正常发芽的时间，表明舟叶橐吾对地下资源的竞争能力比人工草地牧草强。综合效应指数(SE)结果表明，舟叶橐吾浸提液不仅抑制供试牧草的种子萌发、幼苗的生长，而且表现出明显的浓度效应、部位效应，即浓度越大抑制作用越强，根部浸提液的抑制作用比地上部更加明显(图3)，这与其它橐吾种类化感作用研究结果相一致[16，23]。

对化感作用，不同植物的耐受性有差异[24-26]。试验中，我们也发现幼苗生长、种子萌发对舟叶橐吾植株浸提液的响应与牧草种类有关，其中鸭茅的敏感性最强，可能与舟叶橐吾浸提液中所含的化感活性物质有关。据马瑞君等[27]研究，萜类化合物是黄帚橐吾主要的化感活性挥发物质，挥发释放后影响受体植物种子的萌发。酚类物质影响着细胞分裂等关键过程[28]。通过代谢组非靶向测定，我们在舟叶橐吾叶片中发现了283种成分，主要包括4-羟基苯甲酸、苯甲酸、薄荷酮、抗坏血酸等。4-羟基苯甲酸可以通过枯枝、落叶、根部分泌、雨水冲洗等方式向周围环境中释放，当浓度累积到一定程度就会抑制植物的生长[29]。同为酚酸类物质的苯甲酸、咖啡酸、肉桂酸、阿魏酸均可对植物生长产生一定的抑制作用[30-33]。究竟是哪些具体成分在抑制其它牧草的生长，有待进一步深入研究。

4 结论

舟叶橐吾浸提液对供试的3种牧草种子萌发和幼苗生长均产生了抑制效果，且根部浸提液比地上部浸提液产生的抑制作用更强。对于3种受体植物，白三叶受到的抑制作用最明显；鸭茅种子萌发受到的抑制作用强于多年生黑麦草，而幼苗生长受到的抑制程度弱于多年生黑麦草。由此可见，舟叶橐吾的化感作用严重影响3种牧草的发芽和幼苗生长，在人工草地建设中应去除舟叶橐吾。