基于GC-MS代谢组学技术的不同品种猕猴桃果实化学成分差异性研究

赵燕妮， 张 坤， 许牡丹， 雷 靖, 刘 欢,刘 宁, 陈雪峰, 张 迪

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院, 陕西 西安 710021; 2.陕西农产品加工技术研究院, 陕西 西安 710021; 3.陕西省农村科技开发中心 陕西省猕猴桃工程技术研究中心, 陕西 西安 710054)

0 引言

猕猴桃，属猕猴桃科(Actinidiaceae)、猕猴桃属(Actinidia)，是一种药食两用的鲜香可口水果，富含丰富的膳食纤维、微量元素、有机酸、多糖、胡萝卜素、叶黄素、酚类、叶绿素、黄酮类等营养物质，素有“水果之王”、“维C之冠”的美称，具有抗氧化、抗辐射、抗衰老、增强人体免疫力等功效，深受消费者喜爱.我国是猕猴桃的发源地，目前我国猕猴桃种植面积和产量均居世界第一.猕猴桃资源种类繁多，据统计全世界猕猴桃属植物共有54个种21个变种，75个分类单元[1-5].其中海沃德(Hayward)猕猴桃作为新西兰高档猕猴桃主栽品种之一，有浓厚的清香味和较高含量的糖类化合物[6]，其最大特点是果型美、品质优、耐贮藏、货架期长；徐香猕猴桃是我国陕西省眉县猕猴桃主栽品种之一，香味浓厚，酸甜可口，是继海沃德之后最具市场竞争力的世界猕猴桃优势品种之一；哑特猕猴桃是我国陕西省周至县主栽猕猴桃品种之一，果肉碧绿、肉质细腻，具有抗衰老、排毒嫩肤等功效.

化学成分是构成和影响果品风味特征的物质基础.目前，有关不同品种猕猴桃果实的化学成分差异的研究大多局限于常规成分的分析，如蛋白质、脂肪、碳水化合物、纤维素、维生素、微量元素和灰分等[7-9]，缺乏对不同品种猕猴桃果实化学成分差异的全面系统研究.代谢组学作为新兴的组学技术之一，可准确高效地定性、定量地分析生物体内小分子化合物受品种、环境等影响的变化，广泛应用于食品、植物、微生物等研究领域[10-18].目前，基于代谢组学技术的猕猴桃品质特征及化学成分的研究已成为猕猴桃研究的热点之一.

Capitani等[19]基于核磁共振(NMR)的代谢组学方法对猕猴桃果肉的代谢特性进行研究，发现8月份采摘获得的猕猴桃果实中苹果酸和柠檬酸含量最高，采摘时间越晚，越有利于糖类化合物的累积.Lim等[20]基于GC-MS代谢组学方法研究了“Jecy”绿色猕猴桃在自然成熟(NR)和乙烯诱导成熟(ER)下的差异代谢物，发现猕猴桃成熟过程中NR果实中蔗糖、肌醇、柠檬酸和苹果酸含量显著高于ER果实，而ER果实中果糖、葡萄糖和奎宁酸含量显著高于NR果实.

综上所述，目前关于猕猴桃果实化学成分的研究主要集中在常规化学成分的分析，如蛋白质、脂肪和碳水化合物等.猕猴桃代谢组学的研究也主要关注贮藏方法、贮藏时间等对猕猴桃品质影响的研究，而采用代谢组学技术分析不同猕猴桃品种间化学成分差异的系统研究较少.本文以陕西省三个主栽猕猴桃品种(海沃德、徐香、哑特)的果实为研究对象，采用气相色谱质谱联用(GC-MS)方法对不同品种猕猴桃果实的代谢轮廓进行分析，揭示不同品种的代谢特征.本研究可为猕猴桃品种品质的评价及综合利用提供基础数据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选用八成熟猕猴桃(海沃德、徐香、哑特)于2018年10月采自陕西省周至县陕西佰瑞猕猴桃研究院.猕猴桃采摘当天快速低温运回实验室，立即去皮、去籽、破碎后，置于冷冻干燥机干燥成粉，随后存储于-80 ℃冰箱备用.

甲醇，Merck公司；2-巯基吡啶、甲胺盐酸盐及N-甲基-N-(三甲基硅)三氟乙酰胺(MSTFA)，Sigma-aldrich公司，均为色谱级.

1.2 主要仪器

Trace 1300-ISQ GC/MS，赛默飞世尔科技有限公司；JA2003型电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；HWS-24型恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；移液器及5424R高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；SIM FD5-series冷冻干燥机，美国西盟公司；VORTEX-5涡旋混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；实验室常见其他仪器.

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

称取100 mg猕猴桃干粉，加入1.5 mL的80%甲醇水混合溶液，涡旋振荡5 min，14 000 rpm下离心10 min，静止2 min，取上清液500μL冻干.冻干样加入100μL甲氧胺盐酸盐-吡啶溶液(20 mg/mL)，涡旋3 min至样液混匀，在37 ℃水浴衍生90 min，10 000 rpm离心5 min后，加入50μL MSTFA，37 ℃水浴衍生60 min.取120μL上清液待测.

1.3.2 GC-MS分析条件

色谱条件：色谱柱为HP-5 MS(30 m×250μm×0.25μm，J&W Scientific，Folsom，CA)；载气为氦气，采用恒流模式，线速度40.0 cm/s，分流比10∶1；程序升温条件：70 ℃保持3 min，以5 ℃/min速度升至300 ℃，保持10 min.进样口和传输线温度分别为300 ℃和250 ℃.

质谱条件：溶剂切割时间为5.5 min，离子源温度为230 ℃，EI能量为70 eV，全扫质量扫描范围：33～600(m/z),扫描周期(Even time)为0.2 s.

1.3.3 数据处理

原始数据导入Xcalibur(version 4.0，Thermo，USA)软件中转化成CDF格式，随后导入XCMS程序进行滤噪，保留时间对齐，色谱峰检测及匹配等，获得定量表.通过与标准谱图库(如NIST、Fiehn、Wiley等)匹配进行初步定性分析，然后利用标准样品进行结构确认.

采用SIMCA 14.1对数据进行最小二乘判别分析(PLS-DA)；t检验用于筛选差异代谢物(p<0.05)；聚类分析由MeV 4.8.1软件完成.

2 结果与讨论

2.1 基于GC-MS的猕猴桃果实内含成分分析

猕猴桃果实经去皮、去籽、打浆冷冻干燥成粉、衍生化后进行GC-MS分析.GC-MS分析的猕猴桃果实的总离子流色谱图如图1所示.

图1 基于GC-MS猕猴桃化合物总离子流色谱图(以QC样为例)

通过质谱库检索(如NIST、Mainlib等)及标样验证对猕猴桃果实中的代谢物进行结构鉴定，共定性出76个代谢物，其中66个代谢物经过了标样验证，主要包括糖类26个，脂肪酸7个，有机酸11个，氨基酸19个等.其中氨基酸类主要包括缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸等；糖类包括核糖、果糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖等；有机酸类包括阿魏酸、丙酮酸、乳酸等；脂肪酸包括棕榈酸、亚油酸、α-亚麻酸等，如图2所示.

图2 代谢物个数和百分比分布图

2.2 基于GC-MS的不同猕猴桃果实化学成分差异分析

为了监控样品分析过程中的系统稳定性，将质量控制样品(QC)均匀插入到分析序列中，通过XCMS对QC样品代谢产物进行峰匹配，获得峰表.计算归一化峰面积的相对标准偏差(RSD)，结果如图3所示，85%的代谢产物的RSD小于30%，累积占总峰面积的93%.结果表明该分析过程稳定良好，数据可靠，满足代谢组学样品分析要求.

图3 QC样品中代谢物的RSD分布图(蓝色柱形图和红色折线分别表示相对标准偏差占总峰个数的百分比和峰面积累计值所占的百分比)

为了研究不同品种猕猴桃果实的化学差异性，将3个品种的猕猴桃果实的代谢数据进行总峰面积归一化后，导入SIMCA 14.1软件进行偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)(如图4所示).从图4中可以看出,不同品种猕猴桃样品处于95%的置信区间内(Hotelling T2的椭圆内)，说明样品中不存在异常值.PLS-DA分析发现哑特与其他两个品种(徐香和海沃德)在第一个PLS主成分上具有明显分离趋势，徐香和海沃德在第二个PLS主成分上具有明显分离趋势.

图4 不同猕猴桃品种样本的PLS-DA得分图

为了寻找与品种密切相关的重要化合物，将任意两个品种进行t检验，结果表明三组之间两两比较共有20个差异化合物，其中主要包括碳水化合物、脂肪酸和有机酸等.具体结果如表1所示.

表1 不同品种间鉴定的差异化合物

对20种差异化合物进行皮尔森相关系数的聚类分析(HCA)，结果如图5所示.根据差异代谢物的聚类情况，代谢物可直观地分为3组.具体来说，A组的大多数代谢物在徐香中含量最低，主要包括单糖(如葡萄糖、半乳糖、果糖等)和TCA循环中间体(如异柠檬酸)等.B组和C组的化合物在徐香中含量最高，主要包括二糖(如纤维二糖、海藻糖、麦芽糖)和氨基酸(如丙酮酸、天冬氨酸等)等.

图5 差异化合物的热图分析

为了进一步了解不同猕猴桃品种间的代谢途径差异，通过MetaboAnalyst 4.0进行代谢途径分析，结果如图6所示，三个不同品种的猕猴桃果实主要差异化合物涉及到亚油酸代谢通路、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢、甘油脂代谢、TCA循环、淀粉和蔗糖代谢和磷酸肌醇代谢等途径.

图6 差异化合物的代谢通路富集分析

有机酸是影响果实风味的主要因素之一，猕猴桃果实富含多种有机酸(如苹果酸、柠檬酸、抗坏血酸等).苹果酸为天然果汁的重要成份，酸味清爽可口，并有果味的香甜，味道柔和.本研究发现大部分有机酸(苹果酸、丙酮酸、甘油酸)在徐香中含量最高，哑特中含量最低，这提示着徐香的酸味最明显(图7).抗坏血酸又称为维生素C，广泛存在于新鲜果实和蔬菜中，能结合氧而成为除氧剂，可以抑制果蔬的酶促褐变、防止变色、风味变坏等问题.本研究中哑特中含有较高的抗坏血酸，可有效保持果实的新鲜香味.

图7 猕猴桃中差异化合物相对含量变化情况(蓝色、绿色、黄色和红色分别代表有机酸类、单糖类、双糖类、氨基酸类；*、**、***分别代表0.01

猕猴桃的糖类化合物包括单糖、双糖及聚合物，含量约为8%～14%，其组分及含量决定了果实甜味、粘度[21,22].单糖中果糖的甜度是蔗糖的1.8倍，是所有天然糖中甜度最高的糖之一；在相同浓度下双糖相对于单糖粘度较高，部分双糖(麦芽糖、海藻糖)甜度低.本研究中双糖(如纤维二糖、麦芽糖、海藻糖等)在徐香中含量高于其他两个品种，单糖(如果糖、半乳糖等)在徐香中含量最低，而在海沃德中含量较高(图7)，这提示本研究中海沃德的甜味更佳，徐香粘度较高.这与李跃红等[23]研究结果一致.

猕猴桃富含亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、丙氨酸等多种氨基酸，其中天冬氨酸和丙氨酸被称为呈味氨基酸，天冬氨酸呈鲜味、丙氨酸呈甜味[24].本研究发现呈味氨基酸(天冬氨酸和丙氨酸)在徐香中含量最高(图7)，这在一定程度上表明徐香果实味道更鲜美.

3 结论

本实验采用基于GC-MS代谢组学方法对徐香、哑特和海沃德三个品种的猕猴桃果实的化学成分差异进行研究，通过峰匹配、滤噪，保留时间对齐，色谱峰检测及匹配等，获得定量表.通过质谱库检索(如NIST、Mainlib等)及标样验证共定性出76个物质，其中66个物质进行了标准品验证，定性出的物质主要包括糖、脂肪酸、有机酸、氨基酸等.多变量分析表明不同品种猕猴桃的差异较为显著，其中哑特与其他两个品种(徐香和海沃德)在主成分一上具有明显分离趋势，徐香和海沃德在第二主成分上具有明显分离趋势.单变量分析获取三个品种猕猴桃间的差异化合物，研究发现海沃德中单糖(如葡萄糖、果糖、半乳糖等)含量最高，表明海沃德甜味更佳；徐香中双糖、有机酸、TCA循环中间体和氨基酸含量最高，表明徐香粘度高，风味更佳；哑特中抗坏血酸含量最高，可有效保持果实的新鲜香味.