培养基种类与桑黄菌丝生长及黄酮含量的关系研究

李秀娥 郑巧佳 张 蕊 刘 伟 吴其平 李维焕 程显好*

（1. 鲁东大学农学院，山东 烟台 264025；2. 山东利农菌业有限公司，山东 东营 257442）

桑黄（Sanghuangporus vanini）隶属担子菌亚门Basidiomycota、层菌纲Hymenomycetes、非褶菌目Polyporales、多孔菌科Polyporaceae、桑黄孔菌属Sanghuangporus。其子实体味微苦，可入药，利五脏、软坚、排毒、止血、活血，民间常用以治疗淋病、崩漏带下、疮窟积聚、癖软、脾虚泄泻[1-3]。学者研究发现，桑黄子实体提取物具备非常好的抗癌效果，对正常细胞无毒害作用[4]。现代医学研究证明，桑黄提取物对小鼠肝癌 H22、肉瘤S180、肺癌 Lewis、乳腺癌细胞 MCF-7、人源性结肠癌细胞 HT-29等均有良好的抗性，且具有一定的降血糖活性和增强人体免疫力、保肝、治疗关节炎等功效[5-8]。近年来的研究表明，桑黄活性成分主要包括多糖类、黄酮类、酚类、萜类、甾体、香豆素类及生物碱等[9]。其中黄酮类化合物是桑黄中含量较高的一类次级代谢产物，在子实体和菌丝体中均有分布[10]。随着食药用菌产业与现代科学技术的结合发展，目前国内已有少数机构和企业实现桑黄的人工栽培。如何提高人工栽培桑黄中的有效成分含量逐渐成为一个研究热点。黄酮和多糖是桑黄中最重要、也是研究最多的活性成分，其含量高低决定着桑黄的价值[11,12]。

本研究通过观察分析在不同培养基上生长的桑黄菌丝体形态及黄酮产量，筛选出最优培养基，并探讨黄酮的产生规律，以期用于高黄酮含量的桑黄生产。

1 材料与方法

1.1 材料

桑黄菌株LDP1902，为吉林省长春市野外采集所得。

1.2 试剂

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏、硫酸镁、硫酸铵、磷酸氢二钾、琼脂、硼酸、乙酸钠、乙醇、芦丁标准品、玉米浆，试剂均为国产分析纯或化学纯。

1.3 仪器

紫外分光光度计、高频数控超声波清洗器、鼓风干燥箱、生化培养箱、立式压力蒸汽灭菌锅。

1.4 培养基配方

PDA培养基（g/L）：马铃薯 200 g（煮汁），葡萄糖20 g，琼脂 15 g。胡萝卜培养基（g/L）：胡萝卜 200 g（煮汁），葡萄糖20 g，琼脂 15 g。GPC培养基（g/L）：葡萄糖20 g，蛋白胨6 g，玉米浆10 g，琼脂15 g。GPY培养基（g/L）：葡萄糖20 g，蛋白胨6 g，酵母膏10 g，琼脂15 g。麦麸培养基（g/L）：麦麸30 g（煮汁过滤），葡萄糖20 g，琼脂15 g。麦芽培养基（g/L）：麦芽粉50 g（煮汁过滤），琼脂15 g。各培养基pH均自然。

1.5 培养方法

利用PDA培养基对菌种进行活化，12天后用打孔器在长好菌丝的培养基上打孔，将每一块菌种接至事先配好的铺有灭菌玻璃纸的不同培养基正中央，置于28 ℃培养箱中暗培养，各处理重复10次。定期观察菌落形态变化、菌丝生长情况，并测定菌落直径。

1.6 不同培养基、不同培养时间的菌丝体干湿重测定

将接种于不同培养基的桑黄置于28 ℃培养箱内分别培养7天、9天、11天、13天、15天，可在培养基表面形成一层可剥离的菌丝体，每次取每种培养基的3个平板进行测量，揭下铺在培养基上的玻璃纸，用镊子将菌丝体仔细剥离后置于烘箱，60 ℃烘至恒重，测干重。

1.7 不同培养基、不同培养时间的菌丝体黄酮含量测定

（1）样品液的制备。将烘干后的所有不同培养基及不同培养时间的桑黄菌丝体置于50～55 ℃烘箱烘至八成干，取出剪成小碎块，再于60 ℃下烘24 h后粉碎[13]。

样品溶液：取研磨好的桑黄粉末1 g溶于 70%乙醇，定容至10 mL，超声波（40 kHz）提取 2 h，4 000 r/min离心10 min，取上清液备用[14]，以上各处理重复3次。

（2）紫外比色法。显色液：取8.0 g硼酸和1.0 g乙酸钠，加入乙醇溶解，定容至100 mL作为显色液[14]。0.4 mg/mL芦丁标准液：准确称取芦丁标准品20 mg，用70%乙醇溶解并定容至50 mL，摇匀备用[13]。

标准曲线的制定：分别准确吸取芦丁标准液0µL、20 µL、40 µL、60 µL、80 µL、100 µL、120 µL和140 µL于试管中；加70%乙醇至5 mL，再加入5 mL显色液混匀。加相应试剂做空白对照，在紫外分光光度计波长385 nm处测定吸光度。在设定标准液浓度梯度时注意：先设定一个范围梯度，用空白对照溶液校零后，测定并记录其吸光度值，而后测定样品液的吸光度值，并对比梯度是否合适，若不合适，再根据样品液重新设定标准液浓度梯度。最后，以吸光度为纵坐标、芦丁质量为横坐标，制得标准曲线。

吸取样品0.5 mL于试管中，每个样品3次重复；加70%乙醇至5 mL，再加入5 mL显色液混匀；加相应试剂做空白对照，随后放置在比色皿中，在波长385 nm处测定吸光度，根据制作的芦丁标准曲线，计算菌丝体中的黄酮含量。

2 结果分析

2.1 培养基与桑黄菌丝生长的关系

不同培养基上桑黄菌丝的生长速度差异显著（表1）。在PDA培养基上菌丝生长速度快，生长13天，菌落直径即可达9 cm（长满培养皿），而麦麸和胡萝卜培养基的菌丝生长速度居次，需15天；在GPC、GPY和麦芽培养基上生长较为缓慢。由表1还可看出，7～11天菌落直径差异最大，是桑黄菌丝生长最快的阶段。

表1 6种培养基上桑黄菌落直径变化和菌丝不同生长时期的黄酮含量

2.2 不同培养基的菌丝体含水量变化

如图1可知，胡萝卜、麦芽及麦麸3个培养基的菌丝体含水量较高。随着培养时间的延长，每种培养基上的菌丝体含水量都有不同程度的下降。培养第7天，接种在麦芽、麦麸和胡萝卜培养基上的菌丝体含水量分别为89%、87%和86%，而在GPC培养基上生长的菌丝体含水量较低，仅76%。培养第9天，PDA和麦芽培养基上的菌丝体含水量显著下降，其次是GPC，而GPY、胡萝卜和麦麸3个培养基上的菌丝体含水量则变化不大。

图1 不同培养时间和培养基的桑黄菌丝体含水量

总体看，培养7～11天，菌丝体含水量随着培养时间的延长而降低。原因可能是发菌培养第7～11天是桑黄菌丝体快速生长期，期间需要消耗大量水分，转运或溶解基质中的养分，从而转化为自身物质，致使含水量明显下降。

2.3 不同培养基的菌丝体生物量

由图2可知，发菌培养15天，以GPY培养基上的菌丝体干重最大，达到0.3659 g，远超其他5种培养基；麦芽培养基的菌丝体干重最小，胡萝卜培养基也较小；其他3种培养基的干重基本持平。选择第15天进行分析，是因为在生长后期桑黄菌落大，培养时间长，各培养基上的菌丝体对培养基中的营养物质利用已经比较充分并积累了一定的养分，有利于进行比较。菌丝体干重越大，说明该培养基所提供的养分或元素越适宜桑黄菌丝的吸收和生长。

图2 培养15天时不同培养基上菌丝体的干重

2.4 不同培养基上不同时间段的菌丝体黄酮含量

通过芦丁标准曲线及标准曲线方程y=3.8155x-0.0051（R2=0.9977），测定分析不同培养基上的桑黄菌丝体在不同生长时期的黄酮含量差异。结果表明，在不同的生长时间，不同培养基上的菌丝体黄酮含量差异显著（表1）。各培养基的菌丝体黄酮含量总体上都随着培养时间的延长而增加。其中以GPY和麦麸培养基上的黄酮含量整体表现较高，且随时间的延长，含量增加较平稳。培养前期，胡萝卜培养基上的黄酮含量非常低，麦芽培养基上几近为零；但在第13天后胡萝卜、PDA和麦芽培养基上的黄酮含量均有不同幅度的增加，其中以胡萝卜培养基的变化较为显著。培养至第15天，胡萝卜培养基上的菌丝体黄酮含量增加显著，跃居第一，为0.91%。究其原因，可能是在第13天时菌丝已长满培养皿，之后因生长环境局限（即养分不足）而刺激了次级代谢，导致黄酮含量的剧增[15]。

在供试的6种培养基上，菌丝生长初期普遍含一定量黄酮，这可能是由于接种使用的原菌种块含有黄酮所致，其对生长初期较小的新生菌落中的黄酮含量测定结果影响较大。

3 结 论

本试验通过测定分析桑黄菌丝在6种基本培养基培养7天、9天、11天、13天、15天的菌丝体黄酮含量、生长速度、含水量及干重，得出：桑黄菌丝在PDA和胡萝卜培养基上生长速度快，而在GPC和GPY培养基上生长缓慢；菌丝干重，以GPY培养基最大麦芽培养基最小；菌丝体黄酮含量前期以GPY和麦麸培养基较高，培养后期以胡萝卜培养基为高，以麦芽培养基最低。6种培养基的菌丝含水量随着培养时间的延长而降低；菌丝体中的黄酮含量则随时间的延长而增加。

采用固态琼脂培养基培养桑黄菌丝，从黄酮含量看，GPY和胡萝卜培养基是较优的培养基；麦麸培养基上的黄酮含量也高，且成本较GPY培养基低得多，性价比最高。