杜仲miR172基因家族的生物信息学分析与功能预测

叶 靖，杨元玲，史庆秋，吴龙飞，宋国涛

(石河子大学 农学院 林学系，新疆 石河子 832003)

microRNA(miRNA)是普遍存在于动植物体内的长度为18～25 nt的内源非编码RNA。它是真核生物基因表达的重要调控因子，通过介导靶基因mRNA的切割或抑制其翻译，在转录后水平调控靶基因的表达。研究表明，植物的成花诱导、花器官形成、种子形成、果实发育、生物或非生物胁迫响应等重要生命进程都受到miRNA的调控，在植物生长发育过程中发挥重要作用。

miR172是广泛分布于植物中且高度保守的miRNA之一。miR172 家族主要通过调控 AP2/ERF(APETALA2/ethylene responsive factor)类转录因子的表达，从而参与植物生长发育的各个环节。其在拟南芥()的花器官形成和开花时间、大花牵牛()的成花诱导、水稻(L.)的生殖生长、植物叶片由幼叶向成熟叶转变、大豆[(Linn.) Merr.]根瘤形成、马铃薯(L.)块茎形成等过程中起到重要作用。此外，miR172在植物响应干旱、低温、盐等非生物胁迫过程中也发挥重要作用。

杜仲(Oliver)又名思仲、丝棉树等，是我国特有的重要经济树种。因杜仲具有较高的药用价值并且能够生产优质的天然橡胶而备受人们关注，是我国非常重要的国家战略资源。miRNA作为植物基因表达调控的重要研究部分，对探究杜仲的各类生命过程具有重要意义。本研究利用生物信息学手段进行杜仲miR172基因家族前体及成熟体的序列特征分析、系统进化规律研究、启动子预测、靶基因预测及功能分析等，从而系统地了解杜仲miR172基因家族的进化特征及功能，为其在杜仲分子育种中的应用提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

通过杜仲叶片小 RNA 高通量测序数据(登录号：SRP216820)及文献[27]中获取杜仲 miR172家族成员的前体序列和成熟体序列。从miRbase(Release 22.1)数据库 (http://www.mirbase.org/)中下载拟南芥、烟草()、毛果杨()、苹果()、柑橘()、葡萄()、碧桃()7个物种的miR172家族成员的前体序列和成熟体序列。

1.2 方法

1.2.1 eu-miR172家族的进化分析

使用 DNAMAN (ver. 6.0) 软件对杜仲miR172家族成员的成熟体序列进行多重比对，并利用在线软件 WebLogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)分析杜仲miR172家族成员间的碱基保守性，并绘制Logo图。利用MEGA 6.0软件采用邻近法(Neighbor-joining， NJ)构建上述 8 种植物的miR172家族成员成熟体序列的系统进化树，用1 000次重复的自展法(Bootstrap)检验进化树。

1.2.2 eu-miR172 家族前体序列的碱基保守性分析

使用在线软件RNAfold WebServer(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)预测杜仲各 pre-miR172的二级结构，分析参数为软件默认值。pre-miR172 前体序列比对与系统进化树的构建方法同 1.2.1节。

1.2.3 eu-miR172 家族的启动子分析

截取杜仲miR172家族前体上游的2 000 bp序列作为启动子分析区域，利用PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcarehtml)进行启动子结构分析，预测主要的顺式作用元件。

1.2.4 eu-miR172 家族的靶基因预测

使用psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/analysis？function=3)以杜仲转录组的unigene作为候选序列进行靶基因预测，将期望值(Expectation)设置为3，其他参数为默认值。

2 结果与分析

2.1 杜仲 miR172 家族成熟体序列分析

目前，miRBase(Release 22.1)中共收录了223个miR172家族成熟体成员，广泛分布于43个物种中。miR172家族在不同物种中的成员数量差异较大，苹果中的数量最多，有16个；大豆次之，有15个；而二倍体棉花、豆角、快乐鼠尾草、蓖麻等植物中仅有1个成员。本试验结合 sRNA 测序结果和已发表文献，在杜仲中鉴定出8个 miR172 家族成熟体，序列长度在19～22 nt。用WebLogo和DNAMAN软件分析成员间的碱基保守性，发现杜仲 miR172家族成员间仅有7个位点完全保守(图1-A)；但除了eu-miR172d-5p以外，其他7 个成员在第2～19个位点的碱基完全一致，只在序列两端存在变异，且eu-miR172b-3p与 eu-miR172c的成熟体序列完全一致(图1-B)。说明杜仲miR172家族在进化过程中功能相对保守，但也存在功能分化。

为了进一步分析杜仲miR172家族的进化特征，本试验基于模式植物拟南芥、烟草和毛果杨以及其他4种木本植物的miR172家族的70个成熟体序列构建进化树。发现这70个miR172成员被明显地分为两支，其中柑橘、拟南芥、杜仲、碧桃、毛果杨的12个miR172成员被聚为一支，而另一支包括苹果、葡萄、烟草的所有miR172成员以及其他5个物种的大多数miR172成员，说明植物的miR172家族在进化过程中高度保守，但有少部分的成员在进化过程中存在功能分化。除eu-miR172d-5p以外，杜仲的其他7个miR172家族成员被聚在一个主要的大支中，并且它们被聚在一起(图2)，进一步说明杜仲miR172家族在进化过程中高度保守，而个别成员出现了功能分化。

2.2 杜仲miR172家族前体序列分析

通过小RNA测序和文献搜索，共获得8条杜仲miR172家族前体序列。eu-miR172前体序列长度分布在133～250 nt；序列变异较大，保守性仅有25.17%，但在产生成熟体序列的位置高度保守，仅个别碱基存在变异(图3)。使用在线软件 RNAfold (http://rna.tbi.univie.ac.at/) 分析杜仲miR172家族前体序列的二级结构，结果表明，杜仲miR172家族的8条前体均能形成稳定的发夹结构，最小折叠自由能(dG)在-69.50～-48.40 kcal·mol；除了eu-miR172-5p产生于二级结构的5′臂上以外，其余7个成员的成熟体均位于3′臂上(图4)。

从miRbase(Release 22.1)数据库中下载拟南芥、烟草、毛果杨、苹果、柑橘、碧桃、葡萄的所有MIR172成员(共53条)，与本实验的8条杜仲MIR172家族一起构建进化树。结果表明，以上8个物种的miR172家族前体保守性均较低，61个MIR172成员在进化树中的分布较为分散，没有聚集的现象(图5)，说明植物miR172家族前体的进化模式与成熟体不同。

A，碱基序列保守性；B，序列比对。A， Base sequence conservation; B， Multiple sequence alignment.图1 杜仲 miR172 家族成员成熟体序列保守性分析Fig.1 Conservation analysis of mature sequences of miR172 family members from E. ulmoides

eu，杜仲；ath，拟南芥；nta，烟草；ptc，毛果杨；mdm，苹果；csi，柑橘；vvi，葡萄；ppe，碧桃。下同。eu， Eucommia ulmoides; ath， Arabidopsis thaliana; nta， Nicotiana tabacum; ptc， Citrus trifoliata; mdm， Malus domestica; csi， Citrus reticulata; vvi， Vitis vinifera; ppe， Prunus persica. The same as below.图2 植物miR172家族进化树Fig.2 Phylogenetic tree of miR172 family in plant

图3 杜仲 miR172 家族前体序列比对分析Fig.3 Precursor sequence alignment analysis of eu-miR172 family from E. ulmoides

图4 eu-miR172 前体的二级结构Fig.4 Secondary structures of eu-miR172 precursors

图5 植物 MIR172 家族进化分析Fig.5 Evolutionary analysis of plant MIR172 family

2.3 杜仲miR172家族启动子分析

截取杜仲pre-miR172上游的2 000 bp序列作为启动子分析区域，利用在线软件 PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcarehtml)预测顺式作用元件。8 个杜仲miR172家族成员启动子区域均含有核心顺式作用元件TATA-box和CAAT-box；此外，还包含许多其他顺式作用元件，包括光响应元件、逆境胁迫响应元件、生物胁迫响应元件、激素响应元件、分生组织表达元件、厌氧胁迫元件、昼夜节律响应元件、类黄酮生物合成相关元件、胚乳表达元件等。其中，所有miR172家族成员均含有光响应元件，并且种类丰富，包括GT1-motif、MRE、Box 4、TCT-motif、LAMP-element、AT1-motif、AE-box、sp1、GA-motif、chs-CMA1a、chs-CMA2a、GATA-motif、I-box、TCCC-motif。此外，部分miR172家族成员含有干旱胁迫响应元件(MBS)、生物胁迫响应元件(TC-rich repeats)、激素响应元件(TCA-element、SARE、AuxRR-core)、分生组织表达元件(CAT-box)、厌氧胁迫元件(ARE)、昼夜节律响应元件(circadian)、类黄酮生物合成相关元件(MBSI)、胚乳表达元件(GCN4-motif)(表1)，推测杜仲miR172家族参与多种调控途径。

2.4 杜仲miR172家族的靶基因预测及功能分析

表1 杜仲miR172家族启动子区域主要顺式作用元件

为了解杜仲miR172家族各成员的生物学功能，本研究利用psRNAtarget软件为 eu-miR172 家族成员共预测到33个靶基因，各成员的靶基因数量为6(eu-miR172d-5p)～17(eu-miR172j)个。其中，eu-miR172a、eu-miR172a-3p、eu-miR172b-3p和eu-miR172c的靶基因完全相同(表2)，表明eu-miR172家族成员的功能具有很高的保守性。此外，对靶基因进行功能注释，有14个靶基因注释到相应的功能，这些靶基因参与植物的生长发育、响应生物胁迫和非生物胁迫、响应激素调节、油脂合成或降解以及甲基化等生物学过程(表2)，说明eu-miR172家族在杜仲的生命过程中发挥重要作用，并且eu-miR172的功能存在广泛性。

表2 杜仲miR172家族成员的靶基因预测及功能注释

3 讨论

研究miRNA基因家族的系统进化及预测其调控功能对有效利用miRNA进行分子育种具有重要作用。miR172家族是广泛分布于被子植物中极度保守的miRNA家族，在植物生长发育、抗逆胁迫等方面具有重要调控作用。有关miR172在拟南芥、小麦(L.)、水稻、大豆、杨树()等植物中的研究较为深入，但在杜仲中的研究尚处空白。本研究从杜仲叶片小RNA文库以及文献中获得杜仲miR172基因家族的 8 条成熟体序列和 8 条前体序列用于杜仲miR172基因家族分析；此外，在miRbase(Release 22.1)中下载拟南芥、烟草、毛果杨等其他7个物种的所有miR172家族成熟体和前体序列，用于miR172家族的系统进化分析。研究表明，除eu-miR172d-5p以外，杜仲的miR172家族各成员的成熟体序列相似度很高，并且在系统进化树中各物种的miR172成熟体多数被聚为一支，说明miR172在进化上和功能上具有潜在的保守性。但eu-miR172d-5p的成熟体序列与其他7个成员的差异较大，可能是由于他们在前体茎环结构上的位置不同行造成的，这与刘炜婳等的研究一致；并且miR172家族前体序列的保守性较差，在进化树中的聚类较为分散，表明miR172家族在进化过程中还存在特异性，功能也存在分化。

基因启动子结构及顺式作用元件组成可影响其表达特征。杜仲miR172基因家族的启动子区域包含光响应元件、逆境胁迫响应元件、生物胁迫响应元件、激素响应元件等多种顺式作用元件，且不同家族成员的顺式作用元件各不相同，说明miR172基因家族成员在杜仲的不同生命进程中发挥不同作用或者不同成员间起到协同调控的作用。

miR172基因家族是植物中发现较早、研究较多的小RNA家族。研究者们通过基因克隆、高通量测量、基因过表达或基因敲除等手段证实miR172家族能够调控植物叶片发育、根发育、植物块茎和假鳞茎的形成、花器官的形成和发育、果实和种子的发育、植物幼嫩器官向成熟器官的过渡等生命过程。不同物种中miR172家族的靶基因数目和种类差别很大，但几乎所有物种的miR172均能调控AP2或AP2-like基因家族成员，且该基因家族是 miR172调控的主要对象。说明miR172家族的功能具有多样性，同时在不同物种间还存在保守性。本研究为杜仲miR172基因家族预测到33个靶基因，这些靶基因参与植物的生长发育、响应生物胁迫和非生物胁迫、响应激素调节、油脂合成或降解以及甲基化等生物学过程，并且其主要的靶基因为2基因，说明杜仲miR172基因家族功能同样具有保守性和广泛性，其分子调控功能与该小RNA家族在其他物种中的功能相似。本研究结果将为进一步研究miR172家族在杜仲生命过程中的分子调控机制提供一定参考。

4 结论

杜仲miR172家族成员在进化过程中既保守又有一定分化，其主要通过调控2基因的表达在杜仲生长发育中发挥重要调控作用。