铁筷子花瓣中花青素苷成分及含量对其呈色的影响

陈思琪，孟 晗，衡 蒙，金雪花，孔祥莹

(昆明理工大学 建筑与城市规划学院，昆明 650504)

铁筷子(HelleborusthibetanusFranch.)别名黑嚏根草、九牛七、小桃儿七，作为观赏植物又称之为圣诞玫瑰，为毛茛科铁筷子属多年生常绿草本[1-2]，因其在冬季开花、花期长，且花型叶型颇具观赏价值，近年来逐渐成为深受人们喜爱的观赏植物，但因该植物多为国外引种栽培，市价普遍居高，国内对于铁筷子观赏价值的研究鲜有报道，因此开展铁筷子观赏性状方面的研究工作迫在眉睫。

目前有关于毛茛科植物花色的研究已有不少记载，但对于毛茛科铁筷子属植物花色的研究还未见详细报道，前人对铁筷子的研究多以其种子培育[3]、药用价值[4]、叶[5]及根茎化学成分[6-8]方面为主，其观赏性状方面的研究甚少，花色呈色机理尚未清楚。植物花色的呈色与其色素有关[9-11]，这些色素包括三大类：类黄酮、类胡萝卜素和生物碱，花青素苷是类黄酮中最重要的一类水溶性色素[12-13]能够使植物呈现从红到蓝的不同颜色，主要包含了矢车菊素、飞燕草素、矮牵牛素、锦葵素、天竺葵素和芍药素等6类；此外花色的呈色还受金属离子的螯合[14]、液泡pH等[15]多方面因素的影响。本研究选用7个不同花色的铁筷子作为试验材料，对不同品种花瓣中色素成分及含量进行分析，以期解析铁筷子花色呈色机理，为该物种花色改良、新品种培育提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 植物材料

供试植物材料均于2020年12月下旬至2021年1月上旬期间收集并栽培在昆明理工大学园林植物温室中直至花朵开放，选择处于盛花期的不同单株且着色均匀的花瓣作为研究材料。按照颜色将7个品种铁筷子分为红色系(A、B)、紫色系(C)、粉色系(D、E)和黄色系(F、G)(图1)。

图1 铁筷子各色系品种及编号Fig.1 The different varieties and numbers of H. thibetanus

1.2 花色表型测定

每个品种选择3个长势相近的不同单株采集花瓣，利用英国皇家园艺学会比色卡(RHSCC)进行比色和色差仪进行测色，测量环境选择于室内避免阳光直射的区域。使用RHSCC比色卡测色时将花瓣中间部分与比色卡进行比色，以3人在相同的角度和距离条件下观察到的结果为依据记录色系范围。

使用色差仪(CR-400Konica Minolta China investment Ltd.)以光源C/2°为条件测量花色，测量时将花瓣正面平置于干净的白纸上，将激光口对准花瓣中间部位进行测量，每个单株测量3次取平均值。记录测量出的明度(L*)、红度(a*)和黄度(b*)，并利用公式C*=[(a*)2+(b*)2]1/2；h°=arctan(b*/a*)计算出彩度C*和色相角的值h°。

1.3 色素种类及含量分析

1.3.1 花青素苷提取将存于-80 ℃条件下的铁筷子样品取出，放入研钵内用液氮迅速研磨至细粉末状，待液氮挥发后加入配制好的花青素苷提取液(V甲醇∶V水∶V甲酸∶V三氟醋酸=70∶27∶2∶1)提取花青素苷[16]。每250 mg样品加入1 mL提取液，将样品和提取液放入离心管混合，并置于震荡器上充分震荡后放置于4 ℃冰箱内浸提，期间每隔12 h震荡一次，待浸提24 h后用0.22 μm微孔滤膜过滤上清液得到样品，保存于-80 ℃环境下以待检测。

1.3.2 花青素苷成分及含量测定花青素苷含量的测定采用高效液相色谱法-光电二极管阵列检测方法(HPLC-DAD)，检测仪器为Agilent Q-TOF 6540液相色谱质谱联用仪，泵为P680型，自动进样器(UltiMate 3000)，紫外可见光检测器(DAD-100)，柱温箱(TCC-100)，色谱柱为Agilent公司的ZORBAX型SB-C18(4.6 mm×250 mm)，滤镜为5 μm。HPLC测定条件为：设置流动相A、B两项，A相为水∶甲酸∶三氟醋酸=97.9∶2∶0.1；流动相B相为水∶乙腈∶甲酸∶三氟醋酸=62.9∶35∶2∶0.1。进样前先进行超声脱气和0.2 μm超微过滤，进样量为10 μL，柱温25 ℃，流速0.8 mL/min。流动相B的洗脱梯度为：0～3 min，10%～10%；3～30 min，10%～20%；30～40 min，20%～45%；40～45 min，45%～80%；45～56 min，80%～10%；56～65 min，10%～10%；在波长为525 nm处检测花瓣中花青素苷吸收的峰面积[17-18]。采用半定量法计算花青素苷含量，根据HPLC-DAD分析结果，对氯化矢车菊素(Cyanidin chloride)进行线性回归分析，绘制其浓度与峰面积之间的标准曲线，利用待测样品的峰面积计算花青素苷浓度及铁筷子花瓣中花青素苷的含量。所用标准品购于成都普思生物科技股份有限公司。

花青素苷成分的定性分析采用高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱联用技术(HPLC-ESI-MS)选取具有典型特征的样本进行测定，再根据特征离子进行花青素苷结构的推定。液相色谱分析条件及程序同上，质谱检测条件为：电喷雾离子化(ESI)，离子阱分析器，全质量扫描范围(m/z):100～1 700 u；正离子检测模式，毛细管电压为3 500 V，喷雾器压力200 kPa，毛细管出口电压100 V,保护盖出口电压117 V，干燥温度350 ℃，干燥气体流速为8.0 L/min[19]。

1.4 数据处理

采用Excel 2019软件进行数据统计，用SPSS 22软件对数据进行差异显著性分析和逐步多元回归分析。

2 结果与分析

2.1 花色表型分析

通过分析7个品种铁筷子花瓣的明度(L*)、红度(a*)和黄度 (b*)值发现不同品种的铁筷子花色越深则L*值越低(表1)，其中黄色(G)、黄红色(F)及桃粉色(E)的品种L*值相比于深红色(A)、紫红色(B)及紫色(C)品种的L*值较高，且颜色最深的B品种L*值为7个品种中最低的。紫色(C)品种的a*值最高，其次是深红色(A)品种，而两个黄色系品种红度值(a*)是最低的。反观b*值，黄色品种(G)的b*值最高，紫色品种(C)的b*值最低。由于彩度值(C*)是通过a*值和b*计算得到的，因而红度和黄度值对C*值影响比较大，在所测品种中黄色品种的彩度值较高，而紫红色品种的彩度值最低。

表1 铁筷子各品种花瓣花色表型

对7个品种的铁筷子所测的L*、a*、b*值和C*值进行拟合曲线分析，经过相关性检验及分析得出L*值与a*值呈显著的负相关(R2=0.8142)，(图2，A)；L*值与b*值呈显著的正相关(R2=0.7042)，(图2，B)；L*值与C*值呈显著的正相关(R2=0.5522)，(图2，C)，由此说明铁筷子花瓣的b*、C*值均为其花色的明暗程度变化的影响因素。

A为L*值与a*值的相关性分析；B为L*值与b*值的相关性分析；C为L*值与C*值的相关性分析图2 铁筷子花瓣L*与a*、b*和C*的关系Fig.A is the correlation analysis between L* value and a* value; Fig.B shows the correlation analysis between L* value and b* value. Fig.C shows correlation analysis between L* value and C* valueFig.2 The relationship between L* and a*, b*,C* of H. thibetanus flowers

2.2 铁筷子花青素苷结构的推定分析

采用高效液相色谱法在波长525 nm处对铁筷子样品进行检测，结果(表2)显示在供试的7个品种中有2个品种未检测出花青素苷的成分，为桃粉色(E)和纯黄色(G)，其余的5个品种共检测出11种不同类型的花青素苷成分，将它们按保留时间由短到长依次编号为：S1～S11。

表2 铁筷子花瓣中花青素苷HPLC-ESI-MS分析及结构推定

利用HPLC-ESI-MC技术辅助获得样品的特征峰，根据不同保留时间的出峰情况和特征离子的质荷比(m/z)进行推算花青素苷的种类和结构;参照紫外可见光谱440 nm波长下吸收峰与最大波长下吸收峰的比值(A440/Avis-max)判断花青素苷是否发生5位取代，若比值小于20%则5位被糖苷化，比值大于30%时花青素苷的结构为3-O-糖苷类型且5位处未发生糖苷化[20];根据290～340 nm处是否有肩峰的出现判断化合物是否被芳香酸酰基化[21]，以往的研究表明同科植物具有相似的代谢途径，在毛茛科植物中发现含有槐糖修饰的花青素苷[22]，推测在铁筷子花瓣色素成分中可能含有槐糖基团的修饰。

自然条件下的花青素极不稳定，需要与糖类结合形成稳定的花青素苷，再进一步甲基化、酰基化修饰形成不同种类的花青素苷[28]，从而影响植物花色的呈色。花青素的糖基化修饰首先在C-3位[20]，有时进一步C-5、C-7位糖基化[24],花青素苷经过酰基化修饰可形成更具稳定性和显色性的花青素苷，酰基化的基团分为脂肪酰基(主要有乙二酰基、丙二酰基、丁二酰基、乙酰基等)与芳香酰基(主要有肉桂酰基、香豆酰基、咖啡酰基等)[29-30]。

本研究检测出的11种花青素苷中有6种矢车菊素苷(S1、S3、S4、S7、S10、S11)；4种飞燕草素苷(S2、S5、S8、S9)以及一种矮牵牛素苷(S6)，它们分别使植物呈红色、蓝色和紫色。通过紫外可见光分析发现供试的铁筷子品种中所含花青素均只在C-3位置上发生了糖苷化，酰基化修饰多以芳香酰基为主，脂肪酰基为辅。深红色品种的色素成分中有5种花青素苷被芳香酰基修饰，紫红色和紫色品种中均含有4种酰基修饰的花青素苷，粉白色品种中含有3种酰基修饰的花青素苷，黄红色品种中仅含2种酰基修饰的花青素苷。不同糖基、酰基的修饰是导致铁筷子花色差异的一个原因，本研究在铁筷子花瓣中发现含有芳香酰基化修饰的品种花瓣蓝移进而使花色加深。

2.3 铁筷子花瓣花青素苷含量分析

采用标准品半定量法计算7种铁筷子花瓣中总花青素苷含量(TA)，结果显示(表3)品种A(深红色花瓣)中总花青素苷含量最高，品种B(紫红色花瓣)次之，然后依次是品种C(紫色花瓣)、品种D(粉白色花瓣)、品种F(黄红色花瓣)，但在G(黄色花瓣)、E(桃粉色花瓣)中未检测出花青素苷成分。所检测出含有花青素苷的5个品种均含有矢车菊素和飞燕草素，在品种C(紫色花瓣)中除了飞燕草素和矢车菊素之外，还检测到矮牵牛素成分。其中品种A(深红色花瓣)矢车菊素的含量占总花青素苷含量的84.96%，植物呈现出深红色；品种B(紫红色花瓣)中，飞燕草素的含量占总花青素苷含量的75.91%，花瓣呈现出紫红色；品种C(紫色花瓣)中矢车菊素含量占总花青素苷含量的56.79%，矮牵牛素含量占总花青素苷含量的25.10%，飞燕草素含量仅占总花青素苷含量的18.11%;品种D(粉白色花瓣)中，矢车菊素和飞燕草素含量分别占总花青素苷含量的53.11%和46.89%，品种F(黄红色花瓣)中分别为54.54%和45.46%。综上，矢车菊素苷和飞燕草素苷为铁筷子总花青素苷含量的主要贡献者。

表3 不同品种铁筷子的总花青素苷含量和主要花青素苷含量

进一步通过制作拟合曲线来分析花青素苷含量与不同花色之间的关系，将总花青素苷的含量(TA)作为自变量，以所测的L*、a*、b*、C*值作为因变量形成拟合曲线(图3，A～D)。图3显示，总花青素苷含量与红度值(a*)呈正相关,与L*、b*、C*值呈负相关关系，其中与L*值之间的相关性显著(回归系数为0.8671)与a*、b*、C*值之间的相关性不显著。当总花青素苷含量的累积，则a*值增加，花瓣的颜色越趋向红色。

A为总花青素苷含量与L*值的相关性分析；B为总花青素苷含量与a*值的相关性分析；C为总花青素苷含量与b*值的相关性分析；D为总花青素苷含量与C*值的相关性分析图3 铁筷子花瓣TA与L*、a*、b*和C*的关系A shows the correlation analysis between total anthocyanin content and L* value; B shows the correlation analysis between total anthocyanin content and a* value; C shows the correlation analysis between total anthocyanin content and b* value. Fig.D shows correlation analysis between total anthocyanin content and C* valueFig.3 The relationship between TA and L*, a*, b*, C* of H. thibetanus Franch. flowers

将矢车菊素苷、飞燕草素苷含量分别与L*、a*、b*、C*值进行相关性分析，以矢车菊素苷和飞燕草素苷作自变量，L*、a*、b*、C*值作因变量绘制拟合曲线，以此推导数量关系发现色素含量除与红度值(a*)呈正相关外，与L*、b*、C*均呈现负相关，但单一种类的花青素苷含量与L*、a*、b*值之间未见显著的相关性，除飞燕草素苷与L*值之间的回归系数R2=0.511以外，其他系数均小于0.5。

3 讨 论

植物花青素苷的累积量不同影响着植物花色明度、红度、黄度和彩度的变化[12,31],本研究供试的7种铁筷子花瓣的L*值由低到高分别为紫红色、深红色、紫色、粉白色、桃粉色、黄红色、纯黄色，且L*值与总花青素苷的含量TA值呈显著负相关，即随着花青素苷的积累明度下降，这与前人研究的紫花含笑(Micheliacrassipes)[32]、丽格海棠(Riegerbegonia)[33]有关花青素苷含量对花色明度影响的结果一致，说明花青素苷含量的变化是影响铁筷子花色明暗变化的重要因素之一。从花青素苷含量与花瓣的彩度值、红度值方面的分析来看，随着总花青素苷含量增加铁筷子花瓣的彩度值下降，这与王欢等[34]对双色百合(bicolor lily)研究的结论一致；花青素苷含量的增加铁筷子花瓣的红度值也增加，植物花瓣所呈现的颜色越向红色偏移，该结果与前人对贴梗海棠[Chaenomelesspeciosa(Sweet)Nakai][21]研究中花青素苷含量的累积有助于红色形成的结论相符。值得注意的是品种B中总花青素苷含量不是本研究所有品种中最高，但其颜色却是最暗，在关于深色花的相关研究中发现致使花色变深的原因不仅有花青素苷的高积累，还有花瓣显微结构下色素的分布[35]、花瓣的结构特点、不同花青素苷对呈色的贡献[36]以及其他色素(如原花青素苷)的作用等多方面因素，因此本研究中B品种铁筷子颜色深的原因有待进一步研究。

花青素苷的不同成分是影响其花色变化的重要因素，不同的花青素、修饰基团的数量和修饰方式都对植物花色呈色产生不同程度的影响。在检测出花青素苷的5个品种中矢车菊素为主要的色素物质，其次为飞燕草素,在石蒜属(LycorisHerb)植物[31]和耐寒睡莲(Nymphaeaspp.)[13]中也发现矢车菊素和飞燕草素两类花青素为影响呈色的主要物质。矢车菊素苷和飞燕草素苷分别是使植物呈红色和蓝色的重要物质,两者同时存在时可使植物呈现出紫红色。花瓣着色会向含量更高的色素偏移，而其他色素成分则起到辅助作用[37]，在供试材料B品种中检测出2种飞燕草素衍生物和3种矢车菊素衍生物，该品种中飞燕草素衍生物的含量是矢车菊素衍生物含量的3倍多，在两种色素的共同作用下花色呈现紫红色。酰基化的作用使植物蓝色加深[38-40]，本研究发现含有多种酰基化修饰的飞燕草素苷[41]的铁筷子所呈现的紫色越深，即品种B、C中含有2类酰基化飞燕草素苷，而品种A中仅含有1类，品种B、C比A的颜色越向蓝色偏移呈现出越深的紫色。此外，脂肪族酰基化和芳香族酰基化修饰对铁筷子花色的呈现也有影响，通常情况下脂肪族酰基化对花青素苷的颜色变化影响较小[42]，芳香酰基化花青素苷比脂肪酰基化的稳定性更强[43]，在铁筷子花瓣的色素结构分析中发现酰基修饰多以芳香酰基为主，咖啡酰、香豆酰、肉桂酰的修饰可能是铁筷子花色产生差异的因素。

综上，花青素苷的成分及含量是导致铁筷子花瓣呈现不同颜色的主要原因，矢车菊素苷和飞燕草素苷的互作以及酰基化的修饰使铁筷子呈现不同程度的紫色，花青素苷的不同累积量影响了花瓣颜色的明暗变化，从而使铁筷子花瓣颜色丰富。本研究的结果为铁筷子花色呈色机理的研究奠定了基础，为进一步挖掘花色基因、花色改良、培育花色新品种提供一定的参考。