有网脉和无网脉金线莲杂交及分子鉴定

任嘉欣，石 研，罗 怡，曾黎辉

(福建农林大学 园艺学院，福州 350002)

金线莲(Anoectochilusroxburghii)为兰科(Orchidaceae)开唇兰属(Anoectochilus)多年生草本植物，别名金石蚕、金线兰、金线入骨消[1]等，市场上按照地域称福建金线莲、台湾金线莲、浙江金线莲、广西金线莲等。金线莲对于急慢性肝炎、高血脂、心血管疾病和辅助抗肿瘤等方面疗效显著，关于它的研究热度一直持续。此外，金线莲还被大量用于煲汤和制茶，同时还具有较高的观赏价值[2]。福建道地金线莲野生种质资源中经常发现有网脉金线莲(俗称金线莲“母”)和无网脉金线莲(俗称金线莲“公”)混杂，黄颖桢等[3]在对福建金线莲种质资源调查时也发现，野生环境中有网脉植株和无网脉植株有伴随生长的现象，并将其归位同种植物，认为有无网脉是性状分离所致。

杂交育种是植物领域最常见的育种方式之一，目前已广泛应用于金线莲育种，但杂交结实率低及胚败育等问题仍然存在。滕人达[4]报道，尖叶金线莲和圆叶金线莲人工杂交授粉后胚胎败育比例较高，认为受精后障碍和亲本物种间染色体或基因组遗传不兼容是杂交结实率低的主要因素。韩怡等[5]认为花粉活力直接影响授粉、受精及种子结实率。金线莲植株花朵在散粉当天花粉就具有活力，花粉活力随时间推移先上升后下降；贮藏的温度和时间与花粉贮藏期间的活力相关性很大，花粉活力随着贮藏时间的延长而逐渐降低，且室温条件下花粉活力下降速度最快，4 ℃和-20 ℃条件下降速度减慢。同时，滕人达[4]认为金线莲存在着杂交不亲和性，主要表现在柱头和花粉识别方面。易彬[6]在温室栽培金线莲的杂交授粉试验中发现，异花授粉结实率最高；邵清松报道，兰科植物中三分之一的植物都是通过欺骗性传粉来进行物种繁衍的[7]，且大多都是异花传粉，这种异花传粉的方式结实率高，而自花传粉的结实率低。目前已有人工异花授粉结实率的相关研究，但未见对不同网脉类型金线莲授粉结实率的报道，人工异花授粉可改变金线莲结实率低的问题，对于其资源保护与种质创新具有重要的理论价值与现实意义。

金线莲全草均可入药，其性平味甘，主要化学成分为多糖、黄酮、挥发油、三萜、甾体、氨基酸及其配糖体类等，具有降血糖、抗高血压、保肝、抗HBV等药理活性，而金线莲主要有效成分为黄酮、黄酮苷、金线莲苷、多糖等[8]。顾慧芬等[9]报道，不同地区野生金线莲的总黄酮和多糖含量存在差异，且多糖含量的差异明显大于总黄酮含量差异。黄晓萱等[10]测定了尖叶、大圆叶、小圆叶品系金线莲中金线莲苷含量，结果表明3个品系均含有金线莲苷成分，但其含量在同一品系各批次金线莲间相差较大，可能与种苗来源、产地等因素有关，而在不同品系同地种植金线莲间相差不大。那么，福建金线莲主要药用成分及其含量在有网脉植株和无网脉植株之间可能存在着明显差异，同时也受到产地的影响。目前，由于缺少对金线莲品种(系)的高效鉴别和鉴定手段，严重影响了福建省金线莲特色产业的进一步发展[11]。因此，亟待开发快速鉴定金线莲品种(系)及其近缘杂交品种的有效方法。

CDDP (conserved DNA-derived polymorphism)分子标记技术是依据植物中功能基因和基因家族的保守氨基酸序列设计引物，实现快速鉴定不同物种的分子标记手段[12]。由于CDDP是基于功能基因片段设计的引物，因此扩增得到的标记片段可能是目的基因的一部分或与基因紧密连锁，是一种显性标记，具有良好的多态性，在分子标记辅助育种、遗传多样性分析和种质资源鉴定等方面有重要的应用价值[13]。目前CDDP分子标记技术已在其他药用植物遗传多样性分析及种质资源鉴定等方面广泛应用[14]。近年来，用于金线莲的分子标记技术主要有ISSR[3]、SSR[15]等，而鲜见关于CDDP分子标记应用方面的报道。本研究利用ISSR和CDDP联合标记方法对福建道地金线莲有网脉、无网脉亲本及其杂交后代进行鉴定和遗传多样性分析，为合理利用道地金线莲种质资源以及金线莲品种选育提供技术支撑，同时为金线莲的安全使用和品质提供有效保障。

1 材料和方法

1.1 材 料

供试材料为福建武夷山道地金线莲种质资源‘武夷1号’，在种植过程会出现有网脉植株(民间称之为金线莲“母”植株)和无网脉植株(金线莲“公”植株)，选择生长状态良好的林下仿生栽培的有网脉、无网脉植株测定药用成分，并作为杂交亲本，授粉杂交及杂交后代培育在福建农林大学园艺学院园艺植物遗传育种研究所进行。在杂交后代培育过程中我们发现少数缺少横脉的中间脉型，其与无网脉植株叶面的主要区别是否具有纵向主脉，其余性状与无网脉植株极为相似。本试验杂交后代均为F1代，为方便后代脉型统计，暂将缺少横脉植株归为无网脉植株。

选取金线莲有网脉、无网脉亲本植株叶片，杂交组合A(♀有网脉×♂无网脉)子代中有网脉、无网脉植株叶片分别混样，于液氮处理后-80 ℃保存，用于基因组DNA提取。Taq Master Mix购自诺维赞生物技术有限公司，实验中使用的21条CDDP引物和10条ISSR引物由白鲸生物有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 杂交授粉选取金线莲父本花后3 d的花粉，母本在现蕾后去雄，取开放后3～4 d的花朵进行授粉。用镊子在父本蕊柱上取出黄色且具有粘性的花粉块，置于已去除花粉块的母本柱头蕊腔内。授粉后挂牌标记，24 h内不浇水。试验共设4个杂交组合(♀×♂)：A(有网脉×无网脉)、B(无网脉×有网脉)、C(无网脉×无网脉)、D(有网脉×有网脉)。

1.2.2 无菌播种采用即采即播的方式。选用植株上已成熟且尚未开裂的蒴果，在超净工作台上用75%乙醇浸泡处理30 s，无菌水冲洗2遍，用3%次氯酸钠溶液浸泡10 min，无菌水冲洗3遍，置于滤纸上吸干水分，用镊子和解剖刀纵向切开，取出内部种子均匀撒在播种培养基上，先进行24 h暗培养处理，后转至光照培养条件，于温度(23±2)℃、光照强度2 000～3 000 Lx、光照时间12 h/d条件下进行培养，待杂交幼苗长至2～3 cm，对其性状进行统计分析。

1.2.3 药用成分测定金线莲苷提取参照杨碧云等[16]方法，采用Waters Acquity 超高效液相色谱仪进行检测，以C18(17 μm，2.1×100 mm)为色谱柱；流动相为水∶乙腈∶甲醇为90∶5∶5等梯度洗脱； 流速为0.2 mL/min；检测波长为215 nm；柱温为30 ℃；进样为5 μL。类黄酮提取采用可见分光光度法，用植物类黄酮试剂盒(苏州科铭生物科技有限公司)进行提取。总多糖含量提取采用可见分光光度法，用总多糖试剂盒(苏州科铭生物科技有限公司)进行提取。

1.2.4 基因组DNA的提取采用改良CTAB法[17]提取金线莲基因组DNA，采用质量体积分数1.5%琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA，用UV-9000S紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)测定基因组DNA的浓度和质量，-20 ℃冰箱内保存。

1.2.5 ISSR和CDDP标记扩增ISSR-PCR扩增体系为25 μL，包含12.5 μL 2×Taq Master Mix，1 μL 10 μmol/L 引物，1 μL DNA(50 ng/μL)，加灭菌ddH2O补齐体积至25 μL。反应程序为95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，45～60 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。CDDP扩增体系及程序同ISSR。扩增产物在1×TAE电泳缓冲液中用质量体积分数1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，核酸染料染色15 min，JS-2000 凝胶成像分析系统 (上海培清科技有限公司) 扫描并保存电泳图。

1.2.6 数据统计与分析观察亲本性状及授粉后蒴果的发育情况，统计其结实率。记录不同杂交组合种子萌发生长的情况，并对幼苗叶脉类型进行区分，计算其比例。统计ISSR-PCR扩增产物同一位置的条带，有条带记为“1”，无条带记为“0”，利用 Excel 2003软件进行数据统计，利用NTSYS-PC分析软件按照UPGMA法进行聚类分析，构建聚类图，计算各材料间的遗传距离和显著性差异。

2 结果与分析

2.1 金线莲亲本叶脉性状及其植株药用成分含量比较

本试验所选杂交亲本来自于福建武夷山脉，按地区可称为武夷山种，命名为‘武夷1号’。有网脉植株拥有明显的赭石色绢丝光泽网脉，无网脉植株则无网脉，两者除了叶面网脉颜色有明显差异之外，其余性状皆相同(图1)。

a.有网脉金线莲; b.无网脉金线莲图1 金线莲亲本叶片性状a. Plant with leaf veins; b. Plant without leaf veinsFig.1 Leaf morphology of Anoectochilus roxburghii parent plants

同时，由表1可知‘武夷1号’有网脉植株和无网脉植株的类黄酮、总多糖和金线莲苷含量均存在显著差异(P<0.05)。类黄酮和总多糖含量均表现为有网脉金线莲显著高于无网脉金线莲，有网脉金线莲的总多糖含量是无网脉金线莲的1.3倍；而金线莲苷作为金线莲主要药用指标之一，表现为无网脉金线莲的含量显著高于有网脉金线莲，分别为6.92和6.31 mg/g。

表1 有网脉金线莲和无网脉金线莲药用成分含量

2.2 金线莲不同杂交组合结实率和种子萌发率

不同金线莲杂交组合的结实率统计结果(表2)显示，相对于其他组合来说，有网脉×有网脉组合(D组合)的结实率最高(97.37%)，无网脉×无网脉组合(C组合)的结实率仅次于D组合(84.78%)，有网脉和无网脉正反交组合(A、B组合)的结实率相对较低。而且，将所得的果实进行无菌播种后，仍是D组合的种子成活率最高(48.65%)，C组合的种子成活率次之(46.15%)，A、B组合的种子成活率相对来说较低。C、D杂交组合之间的结实率和种子成活率均相差不大，且均高于A、B组合。以上结果表明同一叶网脉类型的金线莲进行杂交，相对不同种类叶网脉类型的金线莲杂交来说，不仅其结实率明显较高，而且其果实的可育性也较高；正反交组合相对比，A组合的结实率和种子成活率分别高于B组合约15%和10%，但总体上成功率相差不大。

表2 不同金线莲杂交组合结实率和种子萌发率

2.3 不同金线莲杂交组合后代叶网脉性状分析

随机选择1000余株杂交幼苗，对其的叶片网脉性状进行统计。由表3可知，A、B、C杂交组合后代中均出现有网脉和无网脉两种脉型的幼苗，而D组合后代中只出现有网脉型的幼苗，可初步推断有网脉为纯合性状，无网脉为杂合性状。有网脉和无网脉正反交(A、B组)组合后代中有网脉∶无网脉比例分别为3.43∶1、2.5∶1，C组合无网脉自交后代中有网脉∶无网脉比例为2.7∶1，比例皆约等于3∶1，说明叶网脉性状应是属于细胞核遗传，由常染色体上的等位基因控制，至少是两对等位基因控制。

表3 金线莲杂交后代幼苗叶片网脉性状统计

2.4 ISSR 和CDDP引物的筛选和杂交后代鉴定

分别用无网脉金线莲和有网脉金线莲及其杂交后代的基因组DNA为模板，对54条ISSR引物和21条CDDP引物进行筛选，选出扩增条带较多且清晰、具有明显特异性条带的引物共10条(4条ISSR引物和6条CDDP引物)。对筛选出的10条引物设置梯度退火温度进行PCR扩增，确定各引物的最佳退火温度(表4)。

表4 ISSR和CDDP引物及扩增结果

利用筛选出的4条ISSR引物和6条CDDP引物对杂交亲本无网脉、有网脉植株及杂交组合A后代中无网脉金线莲和有网脉金线莲植物基因组DNA进行PCR扩增。扩增结果(表4)显示，10条引物共扩增345个条带(位点)，平均每条引物扩增出34.5个条带(位点);多态性位点共129个，平均每条引物扩增出12.9个多态性条带(位点)，平均多态性位点百分率为39.5%。

从图2可以看到，10条引物在不同扩增片段长度下出现了差异性片段(图2方框)，均能有效区分亲本无网脉金线莲和有网脉金线莲，表现为在同一位置大部分有网脉植株没有扩增片段，而无网脉植株扩增出条带；或一部分无网脉金线莲和有网脉金线莲扩增片段大小不同。10条引物中有2条(UBC866和WRKY-R3B)可同时用于鉴定杂交后代，主要表现为杂交组合A后代中有网脉植株扩增出父本无网脉的片段(图2长方框)，经过多次重复实验证明扩增片段稳定存在，可证明为杂交后代。

M.DL2000；W.无网脉金线莲亲本；Y.有网脉金线莲亲本；ZW.杂交组合A后代中的无网脉植株；ZY.杂交组合A后代中的有网脉植株。每4列为一组，1-4.UBC881；5-8.UBC835；9-12.UBC866；13-16.UBC873；17-20.CHI1；21-24.WRKY-F1；25-28.WRKY-R2；29-32.WRKY-R3B；33-36.ANS1；37-40.WRKY-R1。图中长方框显示可同时区分亲本和鉴定亲后代关系的差异性片段，短方框显示只可区分亲本的差异性片段图2 ISSR和CDDP对金线莲杂交组合A亲本及杂交后代的鉴定M. DL2000; W. A. roxburghii without leaf veins; Y. A. roxburghii with leaf veins; ZW. A. roxburghii without leaf veins in combination A hybrid offspring; ZY. A. roxburghii with leaf veins in combination A hybrid offspring. 1-4. UBC881; 5-8. UBC835; 9-12. UBC866; 13-16. UBC873; 17-20.CHI1; 21-24. WRKY-F1; 25-28. WRKY-R2; 29-32. WRKY-R3B; 33-36. ANS1; 37-40. WRKY-R1. The long boxs in the figure are the differential segments that can distinguish the parents and the parent-child relationship at the same time, and the short boxs are the differential segments that can only distinguish the parentsFig.2 Identified the hybrid parents and hybrid combination of a progeny of A. roxburghii by ISSR and CDDP

2.5 金线莲亲本及其杂交后代遗传多样性分析

根据ISSR/CDDP-PCR扩增结果，杂交亲本及其杂交后代的聚类分析结果(图3)显示：金线莲亲本及其杂交后代的遗传距离在0.81～0.85之间；同时亲本无网脉金线莲与有网脉金线莲的遗传距离约为0.04，存在遗传差异。

1.无网脉亲本；2.有网脉亲本；3.无网脉杂交后代；4.有网脉杂交后代图3 金线莲亲本及其杂交后代的聚类结果1. Parent without leaf veins; 2. Parent with leaf veins; 3. Hybrid offspring without leaf veins; 4. Hybrid offspring with leaf veinsFig.3 Cluster diagram of parents and hybrid progeny of A. roxburghii

3 讨 论

本研究以福建道地金线莲种质资源为亲本进行杂交试验。金线莲杂交授粉过程结实率直接受花粉活力程度的影响，不同植物的柱头可授期持续时间不同，花期长短、开花的天数和柱头的分泌物都对柱头的可授性有影响[18]。金线莲花朵的柱头在开花当天就具有可授性[19]。邵清松等[20]研究称人工异株异花授粉的结实率远高于人工自花授粉，结实率最高可达66.3%，并认为在金线莲花后第3天花粉对花后第4天柱头人工异花授粉杂交，可显著提高结实率。易彬[6]研究结果表明在金线莲花后第1天对其进行人工异花授粉杂交结实率最高(83.61%)。本实验选取金线莲开花后第2天的花朵作为父本，开花后第3～4天的花朵作为母本，最高结实率可达97.37%，结果与邵清松研究结果较为接近。邵清松选用的亲本是台湾种金线莲与福建武夷山种金线莲，均在自然条件下开花后进行投粉，而易彬选用的是江西种金线莲，是在温室中于8～9月进行授粉，结实率不同也可能是由于授粉环境或供试金线莲品种不同导致柱头和花粉活性不同。本实验中金线莲正反交成功率相差不大，这与何荆洲等[21]的研究结果不一致，原因可能是何荆洲等选用的金线莲品种差异较大，叶片性状和花色均有差异，而本实验中选用的亲本同来源自福建武夷山地区，只有叶网脉性状不同。

植物类黄酮是金线莲的重要活性物质，对人体来说也具有良好的抗氧化、抗病毒等生理活性，还有较强的细胞毒活性，其含量的多少直接影响着金线莲的药效，郭巧生等[22]研究认为黄酮是金线莲的主要活性成分。张勋等[23]对37批金线莲样品的测定结果表明，金线莲总黄酮含量范围为1.207～3.179 mg/g。朱美瑛[24]对福建、广西和台湾3个地区的金线莲组培苗药用含量进行了比较，结果显示福建金线莲总黄酮含量最高达到15.74 mg/g，远高于广西和台湾金线莲，而其总多糖含量为67.45 mg/g，远低于广西和台湾地区的金线莲。本实验中金线莲亲本植株的类黄酮含量与朱美瑛结果相近，而多糖含量则低于其结果值，这可能是由于种植方式不同所致，但总体上福建道地金线莲药用成分含量较高。黄晓萱等[10]研究测定了尖叶、大圆叶、小圆叶 3 个不同品系金线莲的金线莲苷含量，3个品系均含有金线莲苷成分，其金线莲苷含量均值分别为 23.41%、 25.17%和 21.14%，不同品系间相差不大，这与本实验结果一致。本实验中有网脉金线莲类黄酮和总多糖含量显著高于无网脉金线莲含量，而其金线莲苷含量则略低于无网脉金线莲，说明福建道地金线莲不同品系间的药用成分含量差异较大。

关于有网脉与无网脉金线莲(“公”与“母”)是否为同一品种(系)植物，目前有较大争议。郑纯等[25]认为叶片网脉的明显程度与不同生态环境的光合作用有关；王海阁[26]认为目前金线莲组培苗大多来源于野生，经栽培后存在一定的遗传分化；胡珊梅等[27]在对福建永安同一采集区的野生公、母金线莲进行DNA指纹鉴定，发现两者的指纹图谱部分位点相同，但又有各自特征性位点，认为其存在较大的遗传基因变异，且建议分别独立成种；谢卓宓等[28]在对不同金线莲种质资源样品进行染色体核型分析时发现，同一地区的有线、无线种的SOD、POD、CAT活性和染色体的核型均存在差异。本实验通过对同一地区来源的有网脉、无网脉植株进行药用含量分析，发现两种植株类黄酮、总多糖含量存在显著差异；通过杂交发现有网脉为纯合性状，无网脉植株自交后代出现性状分离。由于杂交后代中出现除有网脉和无网脉以外的中间脉型，但因其叶面性状与无网脉植株极为相似，在统计后代叶网脉性状时暂将其归为无网脉植株。这也可能是杂交组合A、B、C中有网脉和无网脉植株比例近似3∶1的原因之一。但从遗传上可以证明有网脉植株和无网脉植株存在遗传差异，应该属于不同品种(系)，对于杂交后代中缺少横脉这种中间脉型的成因还有待进一步研究。通过ISSR和CDDP分子标记，可以有效区分有网脉和无网脉金线莲。遗传多样性分析结果显示亲本间遗传距离为0.04，说明无网脉金线莲和有网脉金线莲之间存在遗传差异，但亲缘关系较近。综合以上结果推断，来源于武夷山脉的有网脉金线莲和无网脉金线莲是不同品种(系)。

目前ISSR分子标记技术在鉴定金线莲伪品及遗传多样性分析方面应用较多。赵会贤等[29]利用ISSR技术对20份福建省内不同地区金线莲样本进行筛选和扩增，并根据UPGMA聚类分析结果，在遗传距离0.78时将20份金线莲样品分为3类，用以区分不同地区和品种。ISSR分子标记技术可以在分子水平上很好地揭示福建省内金线莲的遗传多样性。但由于ISSR分子标记大多为显性标记，在解决杂交系统、计算杂合度和父系分析等问题时效果不佳[30]。CDDP分子标记作为新型分子标记技术，在金线莲种质资源鉴定方面还未见报道。CDDP分子标记法是基于单引物反应，只对目标基因的保守区域进行扩增，保守区域的序列变异往往较少，可能产生与植物农艺性状相关的标记，因此在鉴定近缘种及杂交后代方面有较大优势[31]。本实验从54条ISSR引物和21条CDDP引物中各筛选出1条可以用于鉴定杂交后代，说明CDDP用于杂交后代的鉴定效率更高。同时可以看出通过CDDP分子标记对亲本间保守功能区域序列的扩增，其多态性优于ISSR分子标记。目前分子标记方法的联合应用，即用两种或两种以上分子标记方法对植物遗传特征进行分析研究，可以弥补不同分子标记间的缺陷和不足，使分析结果更加全面、有效[32]。现阶段关于ISSR、RAPD等标记方法间的比较研究较多，但还未见CDDP标记方法的对比研究。本实验联合应用ISSR和CDDP两种分子标记区分有网脉和无网脉金线莲并鉴定杂交后代关系，达到较好效果。