GC-MS/MS 法分析不同规格卷烟主流烟气醛酮类成分释放量

郭 琼，王晓瑜，潘立宁，杨乾栩，谢复炜，郭吉兆，刘惠民*，陈满堂，朱保昆，张 伟*

1. 中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

2. 云南中烟工业有限责任公司技术中心，昆明市五华区红锦路367 号 650231

醛酮类化合物是卷烟主流烟气中重要的致香成分。同时，一些小分子醛酮如甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、丁酮和丁醛具有感官刺激性，且被列入了烟气44种有害成分的“霍夫曼清单”［1］。目前对于卷烟烟气醛酮类化合物的研究聚焦在烟气中小分子醛酮类刺激性成分，较少涉及烟气醛酮类香味成分的系统分析。2008 年，丁时超等［2］采用2，4-二硝基苯肼衍生-LC-MS/MS 法测定了卷烟样品主流烟气中的甲醛、乙醛、丙烯醛、丙酮、丙醛、巴豆醛、甲基丙烯醛、2-丁酮、丁醛、苯甲醛、戊醛和己醛等32种醛酮类化合物；Ding等［3］对卷烟主流烟气7种小分子醛类有害成分原位衍生，使用UPLC-MS/MS进行定量检测；Pauwels 等［4］研究了不同吸烟行为和卷烟设计对卷烟主流烟气中12种小分子醛类有害成分释放量的影响。在烟气醛酮类香味成分分析研究方面，Pieraccini 等［5］建立了 SPME-GC-MS 法并对不同品牌卷烟主流烟气和侧流烟气中11种醛酮类香味成分进行定量分析；Schwanz 等［6］采用GC×GC-TOFMS法分析不同烟草品种的主流烟气成分，鉴定出46种醛酮类化学感官标记物。然而，有限的几篇关于醛酮类香味成分的报道主要是基于非靶标相对定量方法［5-7］，且检测指标均不超过50种。

近年来，国内细支和中支卷烟销量快速增长，已成为烟草企业和消费市场关注的热点之一［8］。但目前关于不同规格卷烟烟气成分释放量的研究主要集中在细支和常规卷烟在烟气常规成分、部分有害成分及香味成分释放量的比较上［9-11］，而关于中支卷烟与细支、常规卷烟主流烟气差异的研究较少。由于不同规格的卷烟圆周、烟支长度、滤嘴通风率等均不同，可能引起卷烟燃烧状态以及烟气成分在烟柱中的传输、扩散过程发生改变，影响烟气成分的释放量。而卷烟主流烟气中醛酮类化合物的沸点分布范围宽，不仅包括了多糖类、果胶和蛋白质热裂解的产物，还涵盖烟草非酶棕色化反应形成并直接迁移至烟气中的重要香味组分［12］。因此，研究不同规格卷烟主流烟气醛酮类成分释放量差异，可进一步揭示卷烟烟气释放规律。因此，本研究中从国内外烟草添加剂清单及烟草和烟气香味成分分析文献中筛选出158 种醛酮类成分，针对不加香卷烟中可检出的95 种醛酮类香味成分构建了高通量、高灵敏的GC-MS/MS 绝对定量分析方法，并对方法进行了系统表征；采用构建方法和YC/T 254—2008［13］的方法检测了相同烟丝制备的细支、中支和常规规格卷烟主流烟气中的95 种醛酮类香味成分、8 种刺激性的小分子醛酮成分，采用单因素方差分析（ANOVA）法筛选差异化合物，探讨了不同规格卷烟主流烟气醛酮类成分的释放规律，旨在为卷烟产品的开发和维护提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

31种醛类和64种酮类化合物标准品（＞95%，美国Sigma Aldrich公司、北京百灵威科技有限公司、加拿大TRC 公司、江苏艾康生物医药研发有限公司或上海毕得医药科技有限公司）；苯乙烯-d（8＞99%，北京百灵威科技有限公司）；苯乙酮-d（8＞99%，美国Sigma Aldrich公司）；二苯甲酮-d10、邻苯二甲酸二异丁酯-d（4＞98%，加拿大TRC 公司）；二氯甲烷（色谱纯，美国J & T Baker 公司）；Milli-Q 超纯水仪（美国Millipore公司）。

7890-7010 型气相色谱/三重四极杆质谱联用仪、DB-5MS UI 弹性石英毛细管柱（60 m× 0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f.）、DB-624 弹性石英毛细管柱（60 m×0.25 mm i.d.×1.4 μm d.f.）、进样口端串联预柱（5 m×0.25 mm i.d.）（美国Agilent公司）；SM450直线型吸烟机（英国Cerulean 公司）；Sigmole-NYL1111A有机相滤膜（尼龙，13 mm×0.22 μm，上海科醚化学科技有限公司）；44 mm 剑桥滤片（德国Borgwaldt K C 公司）；KQ-500DE 超声波发生器（昆山市超声仪器有限公司）；CP224S型电子天平（感量0.000 1 g，德国Sartorius公司）。

烤烟型叶组由云南中烟工业有限责任公司提供。收集了17个市售中支卷烟产品（覆盖国内14家工业企业）和149 个市售国产烤烟型细支卷烟产品（覆盖国内15家工业企业），均有较好的代表性。根据市售细支、中支和常规卷烟物理参数的实际分布情况（表1），参考3 种类型卷烟的主流设计规格，采用相同烟丝（无添加剂）和相同卷烟纸制备细支、中支和常规实验卷烟样品。

表1 市售细支、中支卷烟物理参数分布①Tab.1 Distribution of physical parameters of slim and medium cigarettes

1.2 方法

1.2.1 卷烟物理参数分析

采用 GB/T 22838—2009［14］的方法测定细支、中支和常规卷烟样品的质量、吸阻、滤嘴通风率、总通风率和圆周等物理参数，结果见表2。

表2 3种类型卷烟样品的物理参数Tab.2 Physical parameters of cigarette samples of three sizes

1.2.2 样品处理

按照 GB/T 16447—2004［15］的要求，将卷烟样品在（22±1）℃、相对湿度（60±3）%的环境中平衡48 h后，挑选平均质量±0.020 g和平均吸阻±30 Pa的烟支作为测试样品。采用ISO 抽吸模式，用剑桥滤片捕集卷烟主流烟气中粒相物；在剑桥滤片捕集器后连接两个串联的吸收瓶，每个吸收瓶中盛有10 mL 甲醇，将其置于异丙醇-干冰冷却（-78 ℃）的冷阱中，用于捕集主流烟气气相物。卷烟抽吸完毕后，将剑桥滤片对折，置于12 mL样品瓶中；加入10 mL二氯甲烷，并加入50 μL内标溶液，超声萃取30 min；取萃取液，用一次性过滤器（注射器中装有有机相滤膜）过滤，收集滤液。

气相部分操作：在每个吸收瓶中准确加入50 μL内标溶液，搅拌均匀；各取1 mL溶液于色谱瓶中，加入50 μL 分析物保护剂。其中，内标溶液为苯乙烯-d8、苯乙酮-d8、二苯甲酮-d10和邻苯二甲酸二异丁酯-d4，浓度均为0.12 mg/mL；分析物保护剂溶液为辛二醇、壬二醇或十四醇，浓度均为20 mg/mL。

1.2.3 8种小分子醛酮类刺激性成分分析

采用YC/T 254—2008［13］的方法测定卷烟主流烟气中甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮和丁醛的释放量。

1.2.4 95种醛酮类香味成分分析

气相物和粒相物萃取液样品均取两份，分别在DB-5MS 和DB-624 两根色谱柱上分离分析。GC-MS/MS分析条件：

方法一：

方法二：

2 结果与讨论

2.1 GC-MS/MS仪器参数优化

对95 种醛酮类香味成分建立GC-MS/MS 分析方法，程序升温条件等色谱参数的优化主要以提高多靶标分析物之间、靶标物与基质干扰成分之间的分离度为准则优化确定，如1.2.4 节所述。本研究中重点优化的质谱参数主要有母离子、子离子和碰撞能量。对目标物及内标的标准品溶液进行全扫描和子离子扫描，选择合适的母离子和子离子；根据响应信号强弱、烟气基质干扰情况，确定定性、定量离子对。各化合物的优化结果见表3。同时考虑到卷烟主流烟气释放量在10 μg/支以上的醛酮类成分，如2，5-二甲基-4-羟基-3-（2H）-呋喃酮、5-羟甲基糠醛、茄酮和糠醛等，应选择丰度较低的离子对，以避免质谱响应饱和。由于95 种醛酮类成分沸点在93.5～323.0 ℃之间，采用一根色谱柱难以兼顾低沸点和高沸点醛酮类成分均与干扰基质良好分离，因此使用非极性的DB-5MS 色谱柱和中等极性、厚液膜的DB-624色谱柱分别对38种和57种醛酮类香味成分进行分离分析。

表3 95 种醛酮类化合物及其内标的MRM 参数①Tab.3 MRM parameters of 95 aldehydes and ketones compounds and their internal standards

表3（续）

表3（续）

2.2 方法评价

2.2.1 标准曲线、精密度、检测限和定量限

以二氯甲烷为溶剂配制标准溶液，并加入分析保护剂（Analyte protectant，AP），采用内标定量法，实验过程中均以5个标准浓度点绘制标准曲线。用实验室参比卷烟烟气样品溶液，以MRM 方式采集，考察95 种醛酮类香味成分测定方法的定量限（LOQ），以10 倍信噪比计算LOQ。在1 d 内（5 个平行抽吸）、连续5 d（每天1个平行抽吸）进行日内及日间精密度测定，计算相对标准偏差（RSD）。由表4可知，各化合物均有良好的线性关系（R2＞0.99），85 种化合物的 LOQ 在 0.9～100.0 ng/支之间；有 9 种化合物在烟气中的释放量较高，在1.1～624.4 μg/支之间，如2，5-二甲基-4-羟基-3（2H）-呋喃酮、5-羟甲基糠醛、甲基环戊烯醇酮、茄酮和反-2-癸烯醛等，LOQ为100.0～3 134.6 ng/支。日内和日间RSD 范围分别为1.4%～11.1%和0.7%～24.3%（其中70 个化合物的RSD＜10%）。因此该方法重复性、灵敏度和准确度较好，适用于卷烟主流烟气醛酮类成分的分析。

2.2.2 基质效应

在GC分析中，基质效应通常表现为基质诱导增强［16］，即由于存在活性位点，导致相同质量分数待测物在实际样品中的响应值高于纯溶剂中的响应值，造成基质加标的回收率偏高。目前基质效应的补偿方法主要有基质匹配标准溶液法［17］和加入分析保护剂法［18］。但是不同于农残分析领域，对于烟气香味成分分析来说，无法找到烟气空白基质，因此本研究中采用加入AP法。AP能有效掩盖进样口和色谱系统的活性位点，可降低活性位点对目标物的吸附作用，是补偿基质效应的有效手段。如Claudia等［19］检测小麦胚芽中120 种农药，在标样溶液中加入1，2，3-戊三醇、L-古洛糖酸内酯和山梨醇作为AP，89%农药的回收率可达70%～120%；林晓燕等［20］测定蔬菜中43种农药残留时添加AP后，发现AP具有显著的基质补偿作用，能够实现对基质敏感农药的保护。由于AP 的氢键能力和挥发性是影响基质效应补偿效果的重要因素［21］，因此本研究中选用带多羟基的二元醇类化合物（辛二醇、壬二醇、十四醇）作为AP。考察了0.2 mg/L各目标物在溶剂与“溶剂+AP”中的色谱峰，12 种物质在“溶剂+AP”/溶剂中的绝对响应比大于2，如4-（4-羟基苯基）-2-丁酮的绝对响应增加了8.2 倍，姜酮的绝对响应增加了4.4 倍。对比了配制溶剂和“溶剂+AP”标准溶液绘制的标准工作曲线，结果表明，溶剂标准溶液绘制标准曲线时，β-萘乙酮、4-（2-呋喃基）-3-丁烯-2-酮、3，4-二甲氧基苯甲醛、姜酮和丁香醛存在明显的基质效应，100 ng/mL 浓度点无信号响应。加入AP 后，待测物的响应和峰型均得到较好改善。“溶剂+AP”标准曲线的线性相关性良好，95 种目标物的R2均大于0.99（表4）。

表4 95 种醛酮类化合物的标准工作曲线、回收率、相对标准偏差和定量限（n=5）Tab.4 Calibration curves, recoveries, relative standard deviations and limits of quantification for 95 aldehydes and ketones compounds（n=5）

表4（续）

按照参比卷烟主流烟气醛酮类成分释放量的50%、100%和200%，向剑桥滤片上分别加入低、中、高3 个浓度水平的标样，计算加标回收率。95 个化合物中，有92个化合物的回收率在70%～120%之间，因此本研究中通过加入AP 有效地补偿了基质效应。而针对其余3 个目标成分，拟采用净化、稀释、AP组合考察等方式进一步开展研究。

2.4 不同规格卷烟主流烟气醛酮类成分释放量

测定了不同规格的18个卷烟样品烟气中的8种小分子醛酮类刺激性成分、95 种醛酮类香味成分的释放量。为进一步分析细支、中支和常规卷烟烟气中差异显著的成分，对数据进行单因素方差分析，共筛选出68 种差异成分（P＜0.01），对卷烟主流烟气醛酮类成分的单位焦油释放量在气相物与粒相物中分布的比值（气粒比）以及沸点进行统计（表5）。

表5 68 种差异醛酮类成分的单位焦油释放量、气粒比、F 值、P 值和沸点Tab.5 Releases per unit tar，gas-particle ratios，F values，P values and boiling points of 68 different aldehydes and ketones components

表5（续）

表5（续）

由表5可知，在细支、中支和常规卷烟中，不同沸点化合物单位焦油释放量的差异较大。对于沸点≤133 ℃的16 种醛酮类成分，常规卷烟烟气释放量高于中支和细支卷烟；沸点≥215 ℃的21 种醛酮类成分仅在粒相中检出，除3-甲基苯乙酮和肉桂醛外，常规卷烟烟气释放量显著低于中支和细支卷烟；对于沸点在133～215 ℃间的31个差异醛酮类成分，除2-庚酮、2-甲基四氢呋喃-3-酮和6-甲基-3，5-庚二烯-2-酮外，中支卷烟烟气释放量高于细支和常规卷烟。这可能是由于3种不同规格卷烟的滤嘴通风率、烟支圆周和长度等参数不同造成的结果。为进一步分析原因，采用宽度为19 mm 的Scotch 胶带单层缠绕滤嘴1圈，100%堵塞滤嘴通风孔，对比分析无滤嘴通风时3种规格卷烟主流烟气释放量。

对于沸点≤133 ℃的成分，如2-己酮、2，3-戊二酮和3-戊烯-2-酮，其气粒比＞1（图1）。如2-己酮在常规、中支和细支卷烟烟气中的气粒比分别为7.73、7.40和8.80，主要分布在气相中，有滤嘴通风时，其单位焦油释放量：常规＞中支＞细支卷烟；无滤嘴通风时，细支卷烟烟气中的单位焦油释放量最低，乙醛和3-戊烯-2-酮的中支卷烟单位焦油释放量最高，2-己酮和2-丁酮的常规卷烟烟气单位焦油释放量最高。且与无滤嘴通风相比，有滤嘴通风时中支和细支卷烟单位焦油释放量降低趋势更明显。这可能是圆周和滤嘴通风交互作用的结果。在图1b中，常规、中支和细支卷烟的滤嘴通风率分别为0、12.5%、33.3%（表2）。滤嘴通风率增加，改变了热解条件，进而改变了烟气释放量，导致燃烧锥周围以及进入烟支的空气流速降低，烟气停留时间延长，使一部分低沸点成分未进入烟支而扩散损失；同时流经滤嘴的烟气流速较低，过滤效率提高，烟气释放量降低。但不同成分单位焦油释放量的降低幅度不同，大多数挥发性成分的释放量降低程度较大，半挥发性成分则较小［22］。这与景延秋等［23］的不同滤嘴稀释度对卷烟主流烟气重要香味成分输送量影响的结论一致，分子量越小的香味成分的输送量越易随滤嘴通风率的增大而减少。但甲醛释放量在不同规格卷烟中没有显著差异，这可能是由于甲醛释放量伴随气流量的增大而增加［24］，又随滤嘴通风导致的扩散稀释而减少，两者交互作用的结果。在图1a中，无滤嘴通风时，这5 种低分子量成分在细支卷烟烟气中的单位焦油释放量最低，中支和常规卷烟与有滤嘴通风时释放情况有所差异。这可能是圆周导致3种规格卷烟的燃烧状态不同引起的。田忠等［25］研究发现细支卷烟的峰值抽吸温度＜600 ℃，明显低于常规卷烟（800～1 000 ℃）。热裂解温度对不同类型化合物释放量的影响有差异，如400～600 ℃时呋喃酮、吡喃酮和酚类化合物的释放量最大，1 000 ℃时氮杂环类化合物和呋喃的释放量最大［26］。

图1 沸点≤133 ℃的成分分别在无滤嘴通风（a）和有滤嘴通风（b）时在常规、中支和细支卷烟主流烟气中单位焦油释放量的归一化结果Fig.1 Normalized releases per unit tar of components with boiling points ≤133 ℃ in mainstream smoke of king-sized，medium and slim cigarettes without（a）and with（b） filter ventilation

对于沸点≥215 ℃的成分，除3-甲基苯乙酮和肉桂醛外，如甲基环戊烯醇酮、香兰素、5-羟甲基糠醛、麦芽酚和乙基环戊烯醇酮等，在无滤嘴通风和有滤嘴通风时，细支卷烟单位焦油释放量均高于中支和常规卷烟（图2）。由于这些成分分布在粒相物中，滤嘴通风对半挥发性组分释放量降低的影响较小，引起的稀释、扩散作用可忽略不计。圆周不同导致烟气烟支轴向传输速度以及燃烧状态改变应是主要的影响因素。相关研究［22，27］也证实了这一解释：一方面，与常规卷烟相比，细支和中支卷烟烟丝燃烧得更加充分。崔晓梦等［27］对比分析了不同圆周卷烟的升温速率，结果表明，圆周越小，抽吸过程中燃烧锥内部升温速率越高。细支卷烟的升温速率较高，有利于高分子量、高沸点化合物生成。另一方面，细支烟的横截面积为常规卷烟的48.2%，为中支卷烟的70.3%，在标准抽吸条件下，细支卷烟烟气通过烟支轴向的流速大于中支和常规卷烟，烟丝段对高分子量、高沸点组分的冷凝和过滤时间减少，导致烟气组分单位焦油释放量较高［22］。

图2 沸点≥215 ℃的成分分别在无滤嘴通风（a）和有滤嘴通风（b）时在常规、中支、细支卷烟主流烟气中单位焦油释放量的归一化结果Fig.2 Normalized releases per unit tar of components with boiling points ≥215 ℃ in mainstream smoke of king-sized，medium and slim cigarettes without（a）and with（b） filter ventilation

对于沸点在133～215 ℃之间的31个差异醛酮类成分（除2-庚酮、2-甲基四氢呋喃-3-酮和6-甲基-3，5-庚二烯-2-酮外），在有滤嘴通风时，其中支卷烟烟气单位焦油释放量较细支和常规卷烟高，如乙偶姻、3-甲基-2-环戊烯-1-酮、糠醛、5-甲基糠醛、2-环戊烯-1-酮等（表5）。这可能是中支卷烟的滤嘴通风率、吸阻、烟支圆周和长度等物理参数数值在细支和常规卷烟之间，多种因素交互作用导致的结果，影响主流烟气的形成，最终造成各成分释放量的差异。具体的影响机理仍需进一步研究。

综合来看，相同烟丝在细支、中支和常规卷烟下，醛酮类成分的释放量和组成比例均发生显著变化，且与化合物的沸点密切相关。这种差异可能是多种因素综合作用的结果，如滤嘴通风影响烟气扩散稀释、烟支圆周导致轴向传输速度差异和燃烧状态的改变等。

3 结论

①基于GC-MS/MS 建立了测定卷烟主流烟气中95种醛酮类香味成分的定量分析方法，与传统方法相比，本方法具有高通量、高灵敏度和准确定性定量等优点。②对于常规、中支和细支卷烟实际样品的检测，可以较好地区分不同规格的卷烟样品，可用于卷烟主流烟气醛酮类香味成分的分析。③常规、中支和细支卷烟主流烟气中各醛酮类成分的单位焦油释放量和化合物沸点相关：对于沸点≤133 ℃的成分，常规卷烟烟气中的释放量高于中支和细支卷烟；对于沸点≥215 ℃的成分（3-甲基苯乙酮和肉桂醛除外），常规卷烟烟气中的释放量显著低于中支和细支卷烟；对于沸点在133～215 ℃之间的成分（2-庚酮、2-甲基四氢呋喃-3-酮和6-甲基-3，5-庚二烯-2-酮除外），中支卷烟的释放量高于细支和常规卷烟。