荧光定量PCR 法定量检测混合烟叶中的红花大金元

李 萌，候宁宁，曲 鹏，王旭东，宋嘉宝，孙九喆，马 林*

1. 郑州轻工业大学食品与生物工程学院，郑州高新技术产业开发区科学大道136 号 450001

2. 河南中烟工业有限责任公司技术中心，郑州市经济技术开发区第三大街8 号 450000

烟叶是卷烟工业企业不可或缺的原料，其质量的好坏直接影响卷烟产品的吸食品质［1］。烟叶质量指标包括外观质量、化学成分和物理特性等方面［2］，受自身生物学特性及栽培、气候等条件的影响，不同烟叶品种在感官和理化特性上存在较大差异，其在各配方中的应用也有所不同。在烟叶收购过程中，由于不同品种烟叶收购价存在差异，混种、混区、混级等现象时有发生，从而导致烟叶质量波动、卷烟配方失真，给工业企业控制卷烟产品质量带来影响［3］。目前烟叶原料的品种鉴定主要以感官评吸和理化检测为主，感官评吸主观性较强而烟叶理化指标受产地、气候及栽培条件的影响较大［4-5］，尚缺乏生产中能够使用的快速、客观且准确的品种鉴定方法。

分子生物学检测方法以物种基因组DNA 序列为检测对象，具有干扰因素少、灵敏度高、稳定性好等优点，可弥补外观和感官检测的不足。RAPD、SCAR 和SSR 等分子标记技术是烟草上研究较多的分子检测技术，可以对烟叶品种进行有效区分［6-9］。如肖炳光等［6］利用18条RAPD引物成功将29个烤烟品种进行区分；马林等［7］采用组合标记策略，利用6个SCAR 引物准确地区分了12 个烟叶品种；孙九喆等［8］筛选出5对SSR引物，实现了11个烟叶品种的快速区分。然而，以上研究虽能对烟叶品种进行有效区分，但无法实现烟叶品种的定量检测。

荧光定量PCR可对检测成分进行相对定量甚至绝对定量的测定，已经普遍用于食品、饲料及药品等特定生物成分的定性、定量检测［10-13］，而在烟草行业中，尤其在烟叶品种的定性、定量检测方面鲜有荧光定量PCR 应用的相关报道。为此，应用TaqMan MGB 探针荧光定量PCR 检测混合烟叶中红花大金元的含量，建立基于荧光定量PCR 的特定烟叶品种定量检测方法，以期为烟叶收购和配方均一性检测等生产环节中的烟叶品种识别、定量检测提供新的技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 材料

以郑州轻工业大学烟草生物技术研究室保存的卷烟企业常用的4个烤后烟叶品种（2017年）为试验材料，品种信息见表1。

表1 4个烤后烟叶品种及编号Tab.1 Cultivars and numbers of four cured tobacco leaf samples

1.1.2 试剂

以实验室前期筛选的SCAR6序列为模板［14］，应用软件 Primer Premier 5.0 设计 5 对 SCAR 引物（表2），由生工生物工程（上海）有限公司合成；利用上海生工在线引物设计网站（https://www.sangon.com/new Primer Design）设计 TaqMan MGB 荧光探针H1-T（表3），并由生工生物工程（上海）有限公司进行合成，该探针5′端标记荧光染料FAM，3′端标记MGB 基团；2×Taq Plus Master Mix Ⅱ和 2×AceQ Universal U+Probe Master Mix V2 购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

表2 5对SCAR引物序列Tab.2 Sequences of 5 SCAR primer pairs

表3 荧光探针H1-TTab.3 Sequence of fluorescence probe H1-T

1.1.3 仪器

JXSF TPRP-2 组织研磨仪（上海净信实业发展有限公司）；NanoDrop 2000 超微量紫外分光光度计（美国Thermo Scientific公司）；DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；Vetiti型梯度PCR仪（美国ABI公司）；Mini Bis Pro 型凝胶成像分析系统（以色列DNR 凝胶成像系统有限公司）；StepOnePlus 型荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems 公司）。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取

红花大金元、云烟85、云烟87 与K326 4 个品种烟叶样品各取0.1 g至1.5 mL离心管中，应用组织研磨仪磨成粉末（2 min，65 Hz），然后参照改良后的CTAB 法［15］操作步骤提取DNA，利用超微量紫外分光光度计和1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的浓度及质量。最后将 DNA 稀释至55 ng·µL-1，-20 ℃保存。

1.2.2 红花大金元特异性引物筛选

SCAR-PCR 扩增反应体系（20 µL）：DNA 模板，55 ng·µL-1、0.5 µL；2×Taq Plus Master Mix Ⅱ，10µL；上下游引物，10 µmol/L 浓度各0.5 µL；ddH2O 加至20 µL；反应程序为：94 ℃预变性6 min；94 ℃变性50 s，引物的退火温度根据表2 结果退火20 s，72 ℃延伸25 s，从变性到延伸反应30 个循环；最后在72 ℃延伸6 min；PCR 产物在4 ℃条件下保存。PCR扩增产物在80 V稳定电压下，以1×TAE作为电泳缓冲液，将质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶置于缓冲液中，上样后电泳40 min，经由紫外凝胶成像系统拍照后，建立凝胶电泳图进行分析。根据电泳结果最终选出特异性强且能产生特异性条带的SCAR引物用于红花大金元品种鉴定。

1.2.3 引物与探针特异性测试

利用筛选好的特异性引物与探针H1-T组合，分别以红花大金元、云烟85、云烟87 和K326 基因组DNA 为模板进行引物与探针特异性测试。荧光定量PCR反应体系如表4所示，反应程序为：37 ℃污染消化2 min；95 ℃预变性5 min；在 95 ℃变性10 s、49 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 30 s 条件下循环 40 次，在此过程收集数据。以ddH2O 为空白对照，根据引物探针组合的扩增曲线形态（S）、Ct 值确定引物的特异性。

1.2.4 荧光定量PCR扩增体系及程序优化

根据引物、探针组合的扩增曲线形态（S）、Ct 值确定最佳引物，设置4 个模板DNA 含量梯度（1、2、3和4 µL），以红花大金元DNA 为模板按照1.2.3 程序进行扩增。

1.2.5 方法灵敏度测试

将红花大金元基因组DNA 用ddH2O 进行梯度稀释，DNA 的浓度分别为 55、5.5、0.55、0.055 和0.005 5 ng·µL-1。利用优化后的荧光定量PCR 扩增体系和扩增程序进行扩增。

1.2.6 标准曲线建立

将红花大金元基因组 DNA（55 ng·µL-1）与ddH2O 混合稀释成不同浓度，红花大金元基因组DNA稀释后的浓度分别为5.5、11.0、16.5、22.0、27.5、33.0、38.5、44.0、49.5 和 55.0 ng·µL-1。将 2 µL 红花大金元基因组DNA 加入到20 µL 反应体系后，其实际浓度分别为0.55、1.10、1.65、2.20、2.75、3.30、3.85、4.40、4.95 和5.50 ng·µL-1。利用以上的红花大金元基因组DNA为模板，通过优化后的荧光定量PCR扩增体系和扩增程序进行扩增。以红花大金元基因组DNA 在20 µL 反应体系中的实际浓度为横坐标，Ct值均值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.7 烟叶基因组DNA预混样品测定

将红花大金元基因组DNA 与云烟85 基因组DNA 按照不同体积比例进行混合。实验中混合样品比例设计如表5 所示，红花大金元基因组DNA 与云烟85的基因组DNA体积比分别为5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0，分别用A、B、C、D、E、F表示，以红花大金元烟叶DNA为模板，用引物与探针组合对样品进行荧光定量PCR扩增，每个样品重复3次，根据荧光定量PCR扩增及标准曲线对红花大金元进行定量分析。

1.2.8 混合烟叶样品测定

将红花大金元分别与云烟85、云烟87 和K326进行混合并编号。1～3 号样品为红花大金元分别与云烟 85、云烟 87 和 K326 按照质量比 5 ∶5 进行混合；4～6 号样品分别为红花大金元分别与云烟85、云烟87 和 K326 按照质量比 7 ∶3 进行混合；7～9 号样品分别为红花大金元分别与云烟85、云烟87 和K326 按照质量比9∶1进行混合。将上述样品磨成粉末，各取0.1 g 于1.5 mL 离心管中，利用改良的CTAB 法提取上述混合样品的基因组DNA，将提取后的DNA 用ddH2O稀释至55 ng·µL-1，并使用荧光定量PCR法进行检测，每个样品重复3次。

2 结果与讨论

2.1 烤后烟叶基因组DNA提取

由图 1 可看出，1～4 号样品 DNA 条带都较为清晰单一，无杂带，主条带亮度高且DNA 条带完整性较好。由表6 可知，提取的基因组DNA OD260/OD280的值在1.8～2.0 之间，纯度较高。利用改良的CTAB法提取的烟叶基因组DNA 质量及纯度达到后续PCR 对DNA 模板的要求。将4 个烟叶样品的DNA用ddH2O稀释至55 ng·µL-1，备用。

表6 烟叶基因组DNA浓度与纯度检测结果Tab.6 Concentration and purity of tobacco genomic DNA

图1 烟草基因组DNA凝胶电泳图Fig.1 Gel electrophoregram of tobacco genomic DNA

2.2 红花大金元特异性引物筛选

以红花大金元、云烟85、云烟87与K326基因组DNA 为模板，对所设计的5 对引物进行筛选。PCR反应条件为1.2.2 节的SCAR-PCR 反应体系与程序。结果（图2）显示，只有引物H1-R/F 以红花大金元基因组DNA 为模板进行PCR 时可扩增出明亮的条带，无其他杂带产生，表明引物H1-R/F 对红花大金元基因组DNA有很强的特异性，可用于红花大金元品种的定性鉴定。

图2 引物筛选结果Fig.2 Screening results by using primers

2.3 引物与探针特异性测试

荧光定量PCR 扩增产物大小在80～200 bp 较为适宜，实验中设计筛选出的引物H1-R/F 符合该要求。利用荧光引物H1-R/F 与探针H1-T 组合，以红花大金元、云烟85、云烟87 和K326 的基因组DNA为模板进行特异性测试。结果（图3）显示，红花大金元出现典型的扩增曲线，其余样品虽有扩增曲线，但Ct 值均大于32，可判定为阴性。以上结果表明该引物、探针组合具有良好的特异性，可以用于下一步试验。

图3 特异性测试结果Fig.3 Test results for specificity

2.4 荧光定量PCR扩增体系及程序优化

利用引物与探针组合H1-R/F/T，设置4 个模板DNA含量梯度（1、2、3和4 µL），进行PCR扩增，确定荧光定量PCR 最佳反应体系。结果如表7 所示，Ct值随着模板DNA 含量的增加而减小。荧光定量PCR Ct值要求在25～30之间，故确定模板DNA的含量为2 µL。

表7 荧光定量PCR体系优化Ct值Tab.7 Ct values of optimized fluorescent quantitative PCR system

2.5 方法灵敏度测试

将红花大金元基因组DNA 用ddH2O 梯度稀释，利用优化后的荧光定量PCR扩增体系和扩增程序进行扩增以确定该方法的检测限。结果（图4）表明，当红花大金元DNA初始浓度大于0.055 ng·µL-1时，扩增曲线的Ct 值≤32；当红花大金元DNA 初始浓度在0.055 ng·µL-1以下时，扩增曲线的Ct 值＞32，模板DNA含量为2µL，可得本方法的检测限为0.11 ng。

图4 灵敏度测试结果Fig.4 Test results for sensitivity

2.6 标准曲线绘制

按照1.2.6节所述方法绘制标准曲线。从结果可以看出（图5、表8），Ct值的RSD范围在0.05%～0.38%之间，重复性较好；标准曲线方程为y =-1.575ln（x）+ 27.156，决定系数R2为0.997。

表8 红花大金元荧光定量PCR方法标准曲线Ct值Tab.8 Ct value of standard curve of fluorescent quantitative PCR for Honghuadajinyuan

图5 标准曲线Fig.5 Standard curve

2.7 预混样品中红花大金元含量测定

将红花大金元 DNA（55 ng·µL-1）与云烟 85 DNA（55 ng·µL-1）按照表5的方式进行混合，以上述DNA 预混样品为模板进行荧光定量PCR。从结果（表9）可以看出，Ct值的RSD范围在0.04%～0.33%之间，重复性较好，数据稳定可靠。通过标准曲线计算得出预混样品A～F 中红花大金元DNA 含量检测值分别为51.36%、61.95%、72.17%、81.18%、87.95%和97.29%，检测值与理论值相对误差分别是2.72%、3.25%、3.10%、1.48%、-2.28%和-2.71%。相对误差均在3.5%以下，表明标准曲线可以对混样中红花大金元含量进行定量分析。

表9 预混样品中红花大金元荧光定量PCR法检测结果Tab.9 Detection results of fluorescent quantitative PCR for Honghuadajinyuan in premixed samples

2.8 混合烟叶样品中红花大金元含量测定

从表 10 可以看出，1～9 号混合烟叶样品 Ct 值重复性较好。应用标准曲线计算得出烟叶混合样品中红花大金元的DNA 浓度，通过红花大金元的DNA浓度和混合烟叶样品DNA浓度之比得出1～9号样品中红花大金元的含量（表10）。红花大金元的检测值均值与理论值的差值在2.5%～3.5%之间，且每个样品3次重复计算得出红花大金元检测值的变异系数小于2%，属于弱变异，结果波动较小。

表10 混合烟叶样品中红花大金元荧光定量PCR检测结果Tab.10 Detection results of fluorescent quantitative PCR for Honghuadajinyuan in mixed tobacco leaf samples

基于荧光定量PCR的烟叶品种定量检测技术的核心在于引物的特异性。本研究中以红花大金元品种特异性序列为基础建立了该品种的定量检测方法，当鉴定靶标品种改变时，需要根据靶标品种的特异性序列重新设计、筛选引物，参照本研究中的流程建立其检测方法。本研究中所用混合样品包含了4个烟叶品种，当品种范围扩大时，需要以新加入品种为模板对引物的特异性进行验证以避免出现假阳性。此外，由于荧光探针法灵敏度较高，对DNA 模板质量和操作精度要求较高，检测过程各个环节均需严格、规范操作以确保实验结果的准确性。

3 结论

通过特异性引物设计、筛选、探针引物组合特异性测试和荧光定量PCR 扩增条件的优化，利用TaqMan MGB 探针法实现了混合烟叶中红花大金元品种的定量检测。以红花大金元品种特异性SCAR序列为基础设计了荧光定量引物和探针，从中筛选出了特异性强、灵敏性高、重复性好的引物和探针组合，在此基础上绘制了标准曲线，最终建立了红花大金元在混合烟叶样品中的定量检测方法。该方法的检测限为0.11 ng，误差范围在2.5%～3.5%之间，精确度高、检测周期短、安全性好，可应用于特定混合样品中红花大金元烟叶的定量检测，为烟叶品种的定量检测提供了新的技术手段。