河南烟区烟草根茎类病害调查及病原鉴定

李小杰，李 琦，刘 畅，邱 睿，白静科，徐 敏，李成军，陈玉国，姚晨虓,3，李淑君*

1. 河南省农业科学院烟草研究所烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室，河南省许昌市魏都区永昌大道 461000

2. 中国烟草总公司河南省公司，郑州市郑东新区商务外环15 号 450018

3. 河南科技大学林学院，河南省洛阳市开元大道263 号 471023

烟草病虫害是影响烟叶安全生产的重要因素之一，每年造成巨大的经济损失［1-3］。据不完全统计，我国烟叶每年因病害造成的直接经济损失约7亿元［4］。目前已知的全球烟草侵染性病害至少有109 种［4-5］，我国烟草上已明确的侵染性病害共有62 种［3］，其中根茎部病害有青枯病、黑胫病、猝倒病、根黑腐病、立枯病、枯萎病、低头黑病、根腐病、白绢病、茎部炭疽病、菌核病和茎点病等［6-8］。近年来，随着烟草种植区域、栽培管理措施、全球气候等因素的改变，烟草病害的种类、分布及其发生危害等均发生了较大变化。苗圃［6］鉴定出河南省烟草根茎部真菌病害11种，其中烟草壳二孢茎枯病（Ascochyta chrysanthemi）和拟茎点霉茎枯病（Phomopsis sp.）为烟草上的新病害，钟器腐霉菌（Pythium vexans）为烟草猝倒病的新病原，烟草茎点病（Phoma sp.）在河南省为首次报道。谭海文［7］首次提出了烟草灰霉病（Botrytis cinerea）为广西烟草生产上新发生的病害。吴元华等［9］报道了烟草靶斑病（Thanatephorus cucumeris）为我国烟草的新病害。尤其是多年连作导致烟草土传病害日益严重，烟草青枯病、黑胫病、立枯病和根腐病等根茎部病害逐年加重［7,10-11］。

河南是典型的浓香型烟叶产区，种烟历史悠久。随着烟草连作年限的增加，土传病害日趋严重，新病害相继出现［6,12］。河南烟区地势西高东低，热量资源年际间变化波动较大，导致不同生态种植区烟草根茎病害种类及发病程度不同［6,13-16］，但近年来关于河南省烟草根茎病害发生种类的系统调查研究还鲜见报道。为了明确河南省各产烟区烟草根茎类病害的发生种类及变化规律，自2017—2019 年连续3年在烟草生产季节进行了病害调查，采集了大量病害样本，并对病原进行鉴定，旨在为河南产烟区烟草生产布局、品种选择及病害的预测预报和综合防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 病害调查及样本采集

2017—2019 年，分别对豫南（信阳、南阳、驻马店），豫东（周口、商丘），豫中（漯河、许昌、平顶山）以及豫西（洛阳、三门峡、济源）等11个烟叶产区大田期烟草根茎类病害进行普查。采集具有典型症状的病害样本644份，其中豫南烟区206份，豫东烟区73份，豫中烟区190份，豫西烟区175份。轻症烟株主要表现在叶片发黄或萎蔫，茎基部有黑/褐色病斑，发病较重的则植株矮小，茎部坏死、根系变褐腐烂。

1.2 病原菌的分离培养

采用组织分离法，将采集的样品用清水冲洗干净，从其病健交界处切取较大块组织，用体积分数为75%的酒精漂洗30 s，放入无菌水中漂洗，然后放入体积分数为15%的次氯酸钠溶液中浸泡3～5 min，再用无菌水漂洗4次，用灭菌滤纸将组织表面的水分吸干，最后将组织材料切成3～5 mm 小块置于PDA培养基中，于25 ℃恒温培养3d。平板出现菌落后挑取菌丝尖端于新的PDA 平板上纯化，直至获得纯菌株。

1.3 病原菌的培养性状及显微观察

将分离纯化菌株置于PDA 培养基上，于25 ℃培养，待分离菌丝长成菌落，用解剖针挑取少量菌丝置于载玻片上，加入几滴无菌水，盖上盖玻片制成临时装片，于显微镜下观察菌丝及分生孢子形态。

1.4 病原菌的ITS鉴定

参照真菌基因组DNA柱式提取试剂盒说明书，提取分离真菌基因组DNA作为模板，应用真菌鉴定通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进 行PCR扩增。PCR反应体系（25 μL）：DNA模板1μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×PCR Taq Master Mix 12.5 μL，双蒸水补足至25 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环；72 ℃延伸 8 min。PCR 产物经质量体积分数为1.0%的琼脂糖凝胶电泳，胶回收后委托上海英潍捷基贸易有限公司完成测序。应用NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行在线比对分析，选择同源性较高的序列用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树。

1.5 病原菌的致病力测定

选择健康的长至6片真叶的烟苗，用灭菌的大头针刺伤茎部表皮，然后切取1 cm×1 cm 的菌丝块贴于刺伤的茎部，用脱脂棉蘸取无菌水保湿。5 d后开始观察烟苗发病情况。

2 结果与分析

2.1 河南烟区烟草根茎类病害的发生及病原鉴定

从2017—2019 年河南烟区烟草根茎类病害普查结果中发现，烟草根茎类病害在河南省11 个产烟区均有不同程度发生，平均发病率在5%～15%之间，个别地块发病较重，烟株出现大面积死亡。由表1和图1 可以看出，采集的644 份根茎类病害样品中共分离培养出519 株真菌菌株和5 株细菌菌株。通过形态学和分子生物学手段，鉴定出疫霉菌（Phytophthora nicotianae）145 株，镰刀菌（Fusarium spp.）273株，立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）65株，齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）3 株，拟茎 点 霉菌（Phomopsis sp.）22 株，辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）6 株，瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）5 株，青枯菌（Ralstonia solanacearum）5 株。其中镰刀菌属真菌的平均检出率最高，占52.10%。其次是疫霉菌和立枯丝核菌，平均检出率分别为27.67%和12.40%，其他5 种病原菌的平均检出率均低于5%。表明由镰刀菌属真菌引起的烟草根腐病、疫霉菌引起的烟草黑胫病和立枯丝核菌引起的烟草立枯病是河南烟区的主要根茎类病害，由拟茎点霉菌引起的烟草茎枯病是烟草上的新病害，近两年的发生率有逐渐上升的趋势。

图1 2017—2019年河南省烟草根茎类病害病原鉴定Fig.1 Pathogen identification of tobacco rhizomatic diseases in Henan Province from 2017 to 2019

表1 烟草根茎类病害样本采集及病原分离Tab.1 Sample collection and pathogen isolation of tobacco rhizomatic diseases

2.2 烟草根茎类病害的生态区分布

疫 霉 菌（Phytophthora nicotianae）、镰 刀 菌（Fusarium spp.）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）和辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）在4 个生态种植区均有分布（图2），其中镰刀菌在4个生态种植区的平均检出率均在50%左右，疫霉菌在豫东和豫西的平均检出率达到20%以上，立枯丝核菌在豫中烟区的平均检出率最高，在15%以上，辣椒炭疽菌平均检出率最低，在1%左右。拟茎点霉菌（Phomopsis sp.）在豫中和豫西烟区的检出率较高，平均检出率在5%左右。齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）、瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）和 青 枯 菌（Ralstonia solanacearum）仅在豫南烟区有检出，平均检出率在4%以下。表明烟草黑胫病、镰刀菌根腐病和立枯病等主要根茎类病害在4个生态种植区均有不同程度发生，其他病害均为零星发生。

图2 2017—2019年不同烟区的烟草根茎类病害病原检出率Fig.2 Pathogen identification of rhizomatic diseases in different tobacco growing areas from 2017 to 2019

2.3 拟茎点霉菌的鉴定

观察发现，拟茎点霉菌在PDA培养基上于25 ℃下培养，菌落生长茂盛，气生菌丝白色棉絮状，具有同心轮纹，菌丝较浓密，20 d后观察菌落颜色加深呈暗黄色，菌丝聚集形成小黑点，即分生孢子器（图3a、3b）。分生孢子无色，椭圆形或纺锤形，具有2个明显的油球（图3c）。

图3 拟茎点霉菌平板培养及分生孢子形态Fig.3 Plate culture and conidium morphology of Phomopsis sp.

利用真菌鉴定通用引物ITS1 和ITS4 对拟茎点霉菌代表菌株编号为NJD-1～NJD-8（表2）的ITS 序列进行PCR 扩增，测序得到长度约为550 bp 的片段。将片段序列与GenBank数据库的基因序列进行同源性比对，这8个菌株的rDNA 序列与拟茎点霉属（Phomopsis）及其有性态间座壳属（Diaporthe）真菌的相似性均在99%以上。系统发育树结果（图4）表明，这8个拟茎点霉菌株与Phomopsis属或Diaporthe属的多个种遗传距离较近且位于系统发育树的同一分支。

表2 拟茎点霉菌代表菌株及来源Tab.2 Representative strains and sources of Phomopsis sp.

图4 拟茎点霉菌的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of Phomopsis sp.

2.4 拟茎点霉菌的致病性

用针刺接种菌丝块法将8 株拟茎点霉菌代表菌株接种到健康的中烟100 烟茎上，5 d 后发现接种NJD-1、NJD-2、NJD-5和NJD-6菌株的烟株接种部位出现褐色病斑，随后沿茎的一侧逐渐向上蔓延，使茎部萎缩，变黄干枯；叶脉失绿，叶片上呈现水渍状病斑，并逐渐萎蔫变干（图5a），表明这4株拟茎点霉菌具有较强的致病性。接种NJD-4 和NJD-7 菌株的烟株接种部位出现褐色病斑，但病斑仅限于接种伤口处，扩展较小（图5b），致病性较弱。接种NJD-3 和NJD-8 菌株的烟株未见发病症状，与对照接种症状相同（图5c）。表明所分离的拟茎点霉菌具有明显的致病性分化。

图5 拟茎点霉菌的回接试验Fig.5 Back infestation test of Phomopsis sp.

3 讨论

已有研究表明，河南省烟草根茎类病害有10余种，其中烟草黑胫病、根黑腐病和根腐病为主要病害［6,13-16］。本研究中从河南省各烟叶产区共分离出烟草根茎类病害的病原8种，其中黑胫病、根腐病、立枯病为主要根茎类病害，这与前人研究的结果稍有不同，可能与近年来气候条件、土壤微生态和耕作制度的变化关系较大。本研究中发现烟草立枯病已逐渐演变为大田期病害，在河南各产烟区大田期均有不同程度的发生危害，已成为河南烟区主要根茎类病害之一，这与谭海文［7］、霍行等［17］的研究结果一致；烟草镰刀菌根腐病的发生已超过烟草黑胫病，平均检出率高达50%以上，且对烟草具有不同程度的致病性［18］，已成为危害烟草的重要根茎部真菌病害；未分离到烟草根黑腐病的病原—基生根串珠霉菌（Thielaviopsis basicola），这可能是由于近年来气候环境等因素的变化易引起高温高湿病害的发生，而低温病害烟草根黑腐病几乎很少发生所致。

拟茎点霉属是重要的植物病原菌，寄主范围广泛，主要危害症状表现为溃疡、果腐、叶枯、枝枯、根腐等［19］，如由扁桃拟茎点霉菌（Phomopsis amygdali）引起的桃缢缩溃疡病是桃生产上重要的病害之一［20］；由油橄榄拟茎点霉（Phomopsis olea-europaea）可引起油橄榄叶枯病［21］。本研究中从豫南、豫中和豫西部分烟区样品中均分离获得拟茎点霉属（Phomopsis sp.）真菌，在培养条件下仅可获得小型分生孢子，能侵染烟株茎部和叶片，这与苗圃［6］的研究结果基本一致，但这些病害的发生范围更广，且不同来源的分离菌株致病力存在显著差异，可能与不同地域环境和栽培条件不同有关，其遗传多样性有待进一步深入研究。

4 结论

由镰刀菌属（Fusarium spp.）引起的烟草根腐病、疫霉菌（Phytophthora nicotianae）引起的烟草黑胫病和立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的烟草立枯病是目前河南烟区大田期的主要根茎类病害。其中烟草根腐病在4个烟草生态种植区均有发生，平均检出率在50%以上，远超过烟草黑胫病和立枯病的发生率，已成为危害烟草的重要根茎类真菌病害。由齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）引起的烟草白绢病、辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）引起的烟草低头黑病、瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）引起的烟草猝倒病和青枯菌（Ralstonia solanacearum）引起的烟草青枯病在个别烟区零星发生，检出率均在5%以下，危害不大。烟草新发生病害—拟茎点霉菌（Phomopsis sp.）引起的烟草茎（叶）枯病的发生近两年有逐渐上升的趋势，生产上应引起重视。